マウス脳組織の2色刺激ラマン散乱イメージング

スライド上のチャンバー内のマウスの脳スライスを取り出し、誘導ラマン散乱(SRS)イメージングシステムを備えた顕微鏡下に置きます。

ポンプビームとストークスビームとして知られる2つの同期レーザービームを組織に焦点を合わせます。

これらのビーム間のエネルギー差は、特定の分子の振動周波数と一致します。 分子振動を誘発する.

同期ビームの異なる周波数ペアを使用して、独特の分子振動を持つ組織脂質とタンパク質を励起します.

励起はビーム間のエネルギー伝達を促進し、ストークスビーム強度を増加させながらポンプビーム強度を低下させます.

相対強度の変化は、分子の識別に役立つSRS信号として検出されます.

光検出器は、結合されたSRSシグナルをサンプルから収集します。

脂質とタンパク質のシグナルに別々の色を割り当てて、2色の画像を作成し、脳組織内のタンパク質と脂質を識別します。

ビームサンプラーをストークスビーム経路に配置して、ビームの10%をピックアップします。そして、それを高速フォトダイオードに送って、8メガヘルツのパルス列を検出します。ファンアウトバッファの出力の1つを取り、バンドパスフィルタでフィルタリングして、20メガヘルツの正弦波を取得します。次に、RF減衰器を使用して、入出力のピーク間電圧を約500ミリボルトに調整します。結果の出力を位相シフタに送信すると、電圧源を使用してRF位相を微調整できます。

この出力をRFパワーアンプに送信し、アンプの出力をEOMに接続します。ストークスビームのブロックを解除した後、ビーム経路にフォトダイオードを配置して、最初のEOMの変調深度を最適化します。変調深度が満足のいくものになるまで、EOM電圧と4分の1波長板を調整します。ダイクロイックミラーの後にフォトダイオードを配置して、レーザービームを検出します。ストークスビームを先にブロックします。次に、オシロスコープのポンプ・パルス・ピークの1つを拡大します。垂直カーソルを置き、オシロスコープでこのピークの時間的位置をマークします。

次に、ポンプビームをブロックし、ストークスビームのブロックを解除します。2つのビームを一致させるのに必要な遅延距離を計算し、次に高速ビームのビーム経路を長くするか、低速ビームのビーム経路を短くすることで、オシロスコープのピーク位置を前のステップのマークされた位置に一時的に一致させる遅延ステージを変換します。

次に、DMSOと両面テープをスペーサーとして、スライドとカバーガラスの間にサンプルを保持する顕微鏡スライドサンプルを準備します。カバーガラス側が顕微鏡の対物レンズに面するようにサンプルを顕微鏡に置き、明視野照明下で接眼レンズからサンプルを観察します。ガラステープ界面の気泡の最上層と最下層の両方でサンプルの焦点を見つけます。次に、テープの2つの層の間に焦点を移動します。

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