マウス脳組織の2色刺激ラマン散乱イメージング

スライド上のチャンバー内のマウスの脳スライスを取り出し、誘導ラマン散乱(SRS)イメージングシステムを備えた顕微鏡下に置きます。

ポンプビームとストークスビームとして知られる2つの同期レーザービームを組織に焦点を合わせます。

これらのビーム間のエネルギー差は、特定の分子の振動周波数と一致します。 分子振動を誘発する.

同期ビームの異なる周波数ペアを使用して、独特の分子振動を持つ組織脂質とタンパク質を励起します.

励起はビーム間のエネルギー伝達を促進し、ストークスビーム強度を増加させながらポンプビーム強度を低下させます.

相対強度の変化は、分子の識別に役立つSRS信号として検出されます.

光検出器は、結合されたSRSシグナルをサンプルから収集します。

脂質とタンパク質のシグナルに別々の色を割り当てて、2色の画像を作成し、脳組織内のタンパク質と脂質を識別します。

ビームサンプラーをストークスビーム経路に配置して、ビームの10%をピックアップします。そして、それを高速フォトダイオードに送って、8メガヘルツのパルス列を検出します。ファンアウトバッファの出力の1つを取り、バンドパスフィルタでフィルタリングして、20メガヘルツの正弦波を取得します。次に、RF減衰器を使用して、入出力のピーク間電圧を約500ミリボルトに調整します。結果の出力を位相シフタに送信すると、電圧源を使用してRF位相を微調整できます。

この出力をRFパワーアンプに送信し、アンプの出力をEOMに接続します。ストークスビームのブロックを解除した後、ビーム経路にフォトダイオードを配置して、最初のEOMの変調深度を最適化します。変調深度が満足のいくものになるまで、EOM電圧と4分の1波長板を調整します。ダイクロイックミラーの後にフォトダイオードを配置して、レーザービームを検出します。ストークスビームを先にブロックします。次に、オシロスコープのポンプ・パルス・ピークの1つを拡大します。垂直カーソルを置き、オシロスコープでこのピークの時間的位置をマークします。

次に、ポンプビームをブロックし、ストークスビームのブロックを解除します。2つのビームを一致させるのに必要な遅延距離を計算し、次に高速ビームのビーム経路を長くするか、低速ビームのビーム経路を短くすることで、オシロスコープのピーク位置を前のステップのマークされた位置に一時的に一致させる遅延ステージを変換します。

次に、DMSOと両面テープをスペーサーとして、スライドとカバーガラスの間にサンプルを保持する顕微鏡スライドサンプルを準備します。カバーガラス側が顕微鏡の対物レンズに面するようにサンプルを顕微鏡に置き、明視野照明下で接眼レンズからサンプルを観察します。ガラステープ界面の気泡の最上層と最下層の両方でサンプルの焦点を見つけます。次に、テープの2つの層の間に焦点を移動します。

次に、チューナブルビーム入出力を798ナノメートルに設定します。コンデンサーの光スループットに基づいて、ポンプの光パワーをそれぞれ約40ミリワットに調整し、対物レンズフォーカスでビームを発射します。次に、Matlabでスキャン画像を開き、フォーカスというラベルの付いたボタンをクリックしてスキャンを開始します。ガルボスキャナーの前のステアリングミラーを調整して、DC信号をチャンネル1ディスプレイの中央に配置します。

電動ディレイステージを動かし、チャンネル2のディスプレイに表示されるロックイン出力を注意深く観察します。最後に、時間遅延を調整して AC 信号強度を最大化します。ダイクロイックミラーを調整して、SRS信号をACチャンネルの中央に配置します。次に、ロックインアンプの位相を調整して信号を最大化します。

サンプルを取り付けた後、顕微鏡にスライドさせ、前述のように、サンプルの焦点で両方のビームの出力をそれぞれ約40ミリワットに調整し、Matlabからのオープンスキャン画像。次に、DMSOの2913逆センチメートルのラマンピークに対応する遅延段をスキャンして、最大SRS信号を求めます。

DMSOの2913逆センチメートルのラマンピークに対応するSRS画像を取得します。ImageJで画像を開き、フレームの中央にある小さな領域を選択します。測定関数を使用して、選択した領域の値の平均と標準偏差を計算します。周波数軸のキャリブレーションの場合は、DMSOの2,913および2,994逆センチメートルのラマンピークをカバーする遅延ステージ範囲でハイパースペクトルスキャンを保存します。

次に、ハイパースペクトルデータセットに対応するステージ位置を保存します。ステージ位置の線形回帰と、2,913 および 2,994 逆センチメートルでのラマン シフトを実行します。線形回帰方程式を使用して、遅延位置を対応するラマン周波数に変換します。スペクトル分解能のキャリブレーションでは、ロッドの挿入により光路長が長くなった前の位置に基づいてステージ位置を推定します。ガラス棒を追加するとビームがわずかにずれるため、ビーム空間のオーバーラップを再調整します。

偏光ビームスプリッター、クォーターウェーブプレート、および2番目のEOMを、最初のEOMの後にストークスビーム経路に取り付けます。2番目のEOMへの信号入力を抜きます。次に、入力された信号を最初のEOMに接続してオンにします。最初のEOMにビームを送信することにより、ストークスビームをメガヘルツで変調します。最初の EOM の傾きと位置を調整して、ビームが EOM 結晶の中心に配置されるようにします。両面テープ、顕微鏡スライド、カバーガラスで組織スライスサンプルを準備します。

カバーガラス側が顕微鏡の対物レンズに面するようにサンプルを顕微鏡に置きます。エピモードSRSイメージングの場合、ビームが顕微鏡に入る前に半波長板を取り付けて、顕微鏡に入るビームの偏光を変化させます。偏光ビームスプリッターを対物レンズの上に配置して、偏光した逆反射ビームが検出器に到達できるようにします。

次に、75アクロマートレンズとミリメートル非球面レンズを使用して、対物レンズの背面開口部から光検出器に後方散乱光子を中継します。検出器を取り付けて、偏光ビームスプリッターによって向けられた後方散乱光を収集します。次に、変調されたビームが検出器に入るのを遮断するフィルターを取り付けます。