透明化マウス脳における無傷の樹状突起アーバーとスパイン形態の共焦点顕微鏡イメージング

蛍

光タンパク質を発現する細胞と脂質を透明に除去したマウスの脳を取り、高解像度の深部構造イメージングを行います。

ヒドロゲルメッシュは生体分子を保存し、ニューロンネットワークを維持します。

サポート用のアガロースリングを含むイメージングチャンバーに脳を移します。

組織を接着剤で固定し、チャンバーを屈折率マッチング溶液で満たして、光散乱を最小限に抑え、安定したイメージング環境を作り出します。

チャンバーを共焦点顕微鏡ステージに置き、対物レンズを溶液にゆっくりと下げて、連続的な接触カラムを確立します。

落射蛍光を使用して、関心領域を特定します。次に、レーザーとイメージングのパラメータを調整して画質を最適化します。

一連の Z スタックをキャプチャして、組織の 3 次元表現を作成します。

適切なソフトウェアを使用して、樹状突起アーバー、その棘、ニューロンの分布と密度などの細胞形態を分析します。

厚さ5ミリメートルを超える組織用の大きな組織イメージングチャンバーを構築するには、壁の高い10センチメートルのガラス皿を使用します。50ミリリットルの円錐形のチューブを中央に置き、チューブの直径が使用する対物レンズの鏡筒を受け入れるのに十分な大きさであることを確認します。3%アガロースを水で作り、ガラス皿と円錐管の間のスペースに注ぎます。

その後、1時間冷まします。これにより、固体アガロースのリングが形成されます。瞬間接着剤を使用して組織をチャンバーの底にしっかりと接着し、空気から保存して摂氏4度で保管しない限り、重合を開始する可能性がある屈折率マッチング溶液をチャンバーに充填します。共焦点顕微鏡を使用して画像を取得します。

関連するすべてのイメージング機器の電源を入れます。サンプルをステージに置きます。対物レンズで浸漬媒体に注意深くアプローチし、連続した媒体の列を形成します。落射蛍光を使用して、適切なイメージングフィールドを見つけます。まず、解像度とスキャン速度の設定を行います。

共焦点顕微鏡を使用してイメージングする場合は、ピンホールを完全に閉じて、最小の光学セクションを取得し、最高のZ解像度を取得します。高い S/N 比で適切な画像が得られるまで、レーザー出力またはセンサー ゲインを徐々に増やします。標準のEGFPまたはtdTomatoの2色イメージングを利用する場合は、集光設定を行います。

組織

の観察された始点と終点に基づいてZスタックパラメータを設定します。希望のZ解像度に基づいてステップサイズを設定します。ステップサイズが小さいほどZ分解能は高くなりますが、サンプルの漂白につながる可能性があります。

画像取得設定に問題がなければ、画像を取得します。画像の信号対雑音比が高く、構造の明確な境界を示していることを確認します。