透明化マウス海馬組織におけるアストロサイトと興奮性ニューロンの2光子顕微鏡法

脂質を除去することによって光学的に透明にした除去されたマウス海馬組織から始めます。組織は生体分子を安定させ、細胞構造を維持するためにハイドロゲルメッシュに埋め込まれています。

組織には、赤色蛍光タンパク質を発現するアストロサイトと緑色の核タンパク質を発現する興奮性ニューロンが含まれているため、明確な視覚化が可能です。

組織をスライドの上に置き、ホットグルーを使用してチャンバーを作成し、小さな隙間を残します。

屈折率マッチング溶液を塗布して組織に水分を補給し、気泡を防ぎ、カバーガラスで密閉します。

チャンバーに屈折率マッチング溶液を充填して、光散乱を減らし、ギャップを閉じます。

2光子顕微鏡で組織を可視化します。

近赤外光は焦点面の赤と緑の蛍光タンパク質を励起し、光損傷を最小限に抑えた高解像度のイメージングを可能にします。蛍光放射は個別に検出され、星状細胞と興奮性ニューロンの核の間の空間的近接性が明確に明らかになります。

まず、サンプルをスライドの中央に置きます。ホットグルーを使用して、スライドの端に組織とほぼ同じ高さの壁を作成します。角の1つに小さな隙間を残してください。ホットグルー層が脳スライスの高さに近づいたら、屈折率に合致する溶液をサンプルに1〜2滴塗布して上面を湿らせ、気泡の形成を防ぎます。

ホットグルーがまだ液体のまま、カバーガラスで上部をシールし、できるだけ均等に配置します。次に、チャンバーに屈折率一致溶液を満たします。ホットグルーで隙間を塞ぎます。ホットグルーの壁がスライドの境界を超えて伸びている場合は、延長端をカットします。油浸対物レンズをイメージングに使用する場合は、カバーガラスの上の壁にさらに2〜3ミリメートルの接着剤を追加して、浸漬溶液を保持します。このプロトコルの後、脳組織は除去されます。