光分画器技術を用いたラット脳組織における新規生成ニューロンの定量化

ミジンのヌクレオシド類似体であるブロモデオキシウリジンまたはBrdUを注射したラットから海馬の脳スライスを採取します。

BrdUは細胞分裂中にDNAに組み込まれ、神経新生の領域である歯状回内で新しく生成されたニューロンを標識します。

酸化剤とインキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ酵素を不活性化します。

酸で処理してDNAを変性させ、BrdUを露出させ、酸を中和します。

細胞膜を透過性化する界面活性剤と、非特異的結合部位をマスキングするブロッキング溶液と一緒にインキュベートします。

BrdUを標的とする一次抗体とインキュベートし、続いて一次抗体に特異的なペルオキシダーゼタグ付き二次抗体をインキュベートします。

色基質と酸化剤を導入し、ペルオキシダーゼが基質を着色残基に変換できるようにします。

組織をマウントし、核酸結合色素で対比染色します。

組織を脱水し、透明性を高めるために処理します。

顕微鏡下で、歯状回を特定します。

光学フラクショネーター技術を使用して、組織の厚さ全体にわたる複数の平面を分析し、BrdU標識ニューロンを定量化します。

染色を開始する準備ができたら、切片を室温まで上げます。次に、絵筆を使用して、一連の海馬切片からPBSで満たされたペトリ皿に配置された25ウェル染色ネットに5番目のセクションを移します。染色のために海馬ごとに8〜12のセクションが必要です。切片を含む染色ネットを、PBSを含む対応するガラス皿に移し、PBSで10分間切片を2回洗浄します。

次に、3%過酸化水素で20分間インキュベートします。洗浄後、3つの塩酸溶液を通して切片を移動させます。次に、室温で0.1モルの四ホウ酸ナトリウムで20分間中和します。

洗浄バッファーを交換して10分間インキュベートを3回行った後、切片をブロッキング溶液に室温で1時間移します。次に、ブロッキング溶液で1〜100に希釈したマウス抗BrdU中で切片を摂氏4度で48時間インキュベートします。

一次抗体のインキュベーション後、洗浄バッファーでそれぞれ10分間3回洗浄し、洗浄バッファーで1〜10に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼで48時間インキュベートします。48時間後、切片をPBSに10分間移し、合計5回の洗浄を繰り返します。洗浄後、切片をDAB溶液に7分間移します。次に、0.02%過酸化水素を含むDAB溶液に10分間移します。

一連の洗浄後、顕微鏡スライドにセクションを番号順に取り付けます。約30分間乾燥させます。次に、サンプルをスライドラックに入れて自然乾燥させます。次に、蒸留水を入れたスライド染色皿でサンプルを10分間再水和します。

次に、スライドを蒸留水中の0.02%クリスタルバイオレットに15分間移します。クリスタルバイオレット染色を繰り返した後、エタノールシリーズを通して切片を再水和します。次に、キシレンで切片を2回、毎回15分間クリアします。最後に、急速乾燥性の封入剤を追加し、スライドをカバースリップします。

24時間後、スライドは顕微鏡検査に使用できます。まず、顕微鏡の電動ステージにスライドを置き、次に立体学ソフトウェアを開いて、組織の厚さを確認します。100倍の油浸対物レンズに変更する前に、低倍率の対物レンズを使用して関心領域を描写します。

次に、会計フレーム内の特定のポイント(たとえば、コーナーに隣接する領域)を選択し、セクションの一部のフィーチャに焦点が合うまで焦点面に沿って移動して、セクションの上部を見つけます。このz位置を0として登録します。次に、組織の最後のzレベルに焦点が合うまで焦点面を組織全体を下に移動し、この位置に印を付けます。局所組織の厚さは 0 からこのエンドポイントまで定義され、Z 軸で読み取ることができます。

組織の厚さを登録します。組織の厚さは、関心領域内のいくつかの場所で測定されます。解剖器とガードゾーンの高さ、カウントのサイズ、ステップの長さをフレーム化し、最終的な倍率はパイロット研究で決定されます。これで、通常、2,000倍から3,000倍の最終倍率で、60倍または100倍のオイル対物レンズと高い開口数を使用して、BrdU陽性ニューロンのカウントを開始できます。

各カウントフレームでBrdU陽性ニューロンを特定しますが、赤い除外線に触れているニューロンはカウントしません。緑色の封入線に触れるBrdU陽性ニューロンと、カウントフレームの境界内にあるニューロンを数えます。BrdU陽性ニューロンは、関心のある特徴が解剖器の高さ内で明確に認識されている場合にのみカウントします。ここに示されている半可視ニューロンはカウントされません。