蛍光顕微鏡法を用いたショウジョウバエの蛹眼のライブイメージング

目が露出したトランスジェニックショウジョウバエの蛹から始めます。

蛹を水和紙フレーム内のゼリービーズの上に置き、ゼリーリングで囲みます。

蛹の目には、発達中の目の神経上皮の細胞境界を強調するGFPタグ付き接合部タンパク質が含まれています。

カバーガラスを蛹の目の領域にそっと押し付けます。

蛍光顕微鏡下では、GFPタグ付き接合部が蛍光を発し、神経上皮組織を示します。

さまざまな深さにわたって一定の間隔で画像を撮影し、画像を処理してコントラストを高め、バックグラウンドノイズを最小限に抑えます。

これらの画像を時間間隔を長くして位置合わせして、発達中の神経上皮を追跡します。

最初は、初代細胞は光受容体細胞クラスターの周囲に境界を形成しますが、細胞間細胞またはICは単一の層に配置されます。

その後、ICは光受容体の近くで二次細胞と三次細胞に分化します。

最後に、余分なICはプログラムされた細胞死によって除去され、組織化された眼を構成する六角形の格子が形成されます。

鉗子を使用して、鰓蓋を慎重に持ち上げて取り外し、蛹の頭を露出させます。次に、蛹ケースの側面に沿って引き裂き、片方の目の周りを露出させます。粘着テープから蛹をそっと取り除きます。

あぶらとり紙で15平方ミリの小さなフレームを作り、真ん中に5ミリの穴を開けます。フレームを蒸留水に浸し、顕微鏡スライドの中央に置きます。30ccのシリンジで、ワセリンの均一なリングを絞り出して、あぶらとり紙のフレームを囲みます。

次に、ワセリンの小さなビーズをスライドに直接加えます。蛹を慎重に横に並べ、ワセリンビーズで支えます。ワセリンリングの上にカバーガラスを置き、目の上の上皮に接触させます。製剤を穏やかに圧縮してカバーガラスをワセリンに密閉し、瞳孔の目の領域とカバーガラスの間に小さくて平らな接触面を生成します。

蛍光顕微鏡を使用して蛹の準備を画像化します。接着接合部の領域にある眼の神経上皮の頂端ドメインを通る連続切片を7分ごとにキャプチャします。適切なデコンボリューションソフトウェアを使用して、背景を減らし、シリアルセクション画像のコントラストを高めます。

LAS AF ソフトウェアの各 z スタック ファイルについて、[ツール]パネルに移動し、[3D デコンボリューション]を選択して、[適用]をクリックします。デコンボリューションされたスタックファイルごとに最大投影法(MPイメージ)を生成します。Photoshop CS5 の組み込みアルゴリズムを使用して、各 MP 画像を整列させて個々の細胞の挙動を強調し、生物の増殖によって引き起こされる気を散らすものを軽減します。

メインメニューの「ファイル」タブから「スクリプト」を開き、「ファイルをスタックにロード」を選択します。次に、MP画像ファイルを[レイヤーの読み込み]パネルにインポートします。[ソース画像を自動的に整列しようとします]オプションが選択されていないことを確認します。そうしないと、画像データが歪む可能性があります。すべての MP ファイルがレイヤー ペインに読み込まれたら、すべての画像が時系列順に並んでいること、および最も早い時点がレイヤー スタックの先頭にあることを確認します。必要に応じて、正しく注文されるまでドラッグ アンド ドロップします。

次に、[レイヤーの自動整列]を選択します。[再配置]を選択し、[OK]をクリックします。