蛍光顕微鏡を用いた硬膜細胞の感覚ニューロンの起源の調査

ド

レープで覆われた頭蓋骨が露出した麻酔をかけたラットを取ります。

穴を開けて、三叉神経節と頸椎後根神経節に由来する痛みに敏感な感覚ニューロンによって神経支配されている脳の最外層である硬膜を露出させます。

漏れを防ぐためのバリアを構築し、逆行トレーサーを導入し、穴を塞ぎます。

傷を縫合し、ラットを回復させます。

トレーサーは感覚神経軸索に入り、その神経節まで逆行して移動し、神経細胞体に入ります。

ラットを安楽死させ、神経節を解剖します。

神経節のセクションを準備し、スライドに取り付けます。

細胞膜を透過性化し、非特異的結合部位をマスクする溶液を加えます。

トレーサーおよび感覚ニューロン特異的神経ペプチドを標的とする一次抗体とインキュベートします。

一次抗体に特異的な蛍光標識二次抗体を追加します。

蛍光顕微鏡を使用して、細胞体内の神経ペプチドとトレーサーの共局在を観察し、感覚ニューロンの神経節起源を確認します。

電気カミソリでネズミの頭を剃る。次に、鈍いイヤーバーをラットに置き、定位固定装置の上に置きます。マウスホルダーを配置し、目に眼科用軟膏を塗ります。75%エタノールを使用して頭の皮膚の手術部位を洗浄し、頭皮の正中線に沿って切開します。

滅菌綿の

先端アプリケーターを使用して、骨膜と筋肉組織を頭蓋骨から鈍く取り除きます。中髄膜動脈の上の左頭頂骨と側頭骨に丸い先端ビットを備えたバリドリルを使用して小さな穴を開けます。歯科用ケイ酸塩セメントで穴の周りに土手を作り、10マイクロリットルのマイクロシリンジで中髄膜動脈の周りの穴に2マイクロリットルのフルオロ金を追加します。

止

血スポンジの小片で穴を覆います。穴にパラフィンフィルムを置き、端を骨ワックスで密封します。滅菌糸で傷を縫合します。ネズミが完全に回復するまで暖かい場所に保管し、その後ネズミをケージに戻します。

7生存日後、これらのラットに0.9%生理食塩水を灌流し、続いて0.1モルリン酸緩衝液に4%パラホルムアルデヒドを灌流します。TGと頸部1〜4個のDRGを解剖し、クライオスタットミクロトームシステム上で矢状方向に30マイクロメートルの厚さで切断します。シランコーティングされたスライドガラスにセクションを取り付けます。

組織化学的ペンで切片を丸で囲み、ブロッキング溶液で30分間インキュベートします。サンプルをウサギ抗フルオロゴールド抗体とマウス抗CGRP抗体の溶液に移し、摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、切片を0.1モルのリン酸緩衝液で3回洗浄します。洗浄切片をロバ抗ウサギAlexa Fluor 594およびロバ抗マウスAlexa Fluor 488二次抗体の混合溶液でインキュベートします。次に、0.1モルのリン酸緩衝液で3回洗浄します。そして、観察のために50%グリセリンを含むカバーガラスを適用します。蛍光顕微鏡を使用して、UV