共焦点顕微鏡法を用いたゼブラフィッシュにおけるレーザーアブレーションニューロマスト間細胞の回収率のモニタリング

まず、蛍光標識された神経間マスト細胞またはINMCを含むゼブラフィッシュの幼虫をカバーガラスに取り付け、共焦点顕微鏡下に置きます。

INMCは、以前にレーザーアブレーションを受けた再生能力を持つ前駆細胞です。

まず、損傷した部分を蛍光モードで観察します。蛍光がないため、レーザーアブレーションが成功したことが確認されます。

次に、透過光イメージングモードを使用して、細胞が顆粒状で不規則な核で腫れているように見える損傷領域を調べ、細胞死を確認します。

部位へのマクロファージの動員は、損傷に対する活発な細胞応答を示しています。

次に、蛍光モードに戻し、定期的にタイムラプス画像をキャプチャして回復を監視します。

回復段階では、INMCはギャップに投影を拡張し、閉鎖を促進し、細胞の修復を促進します。

これらの時系列画像は分析のために保存します。アブレーション領域に明確な蛍光が再出現すると、細胞の回復が成功したことが確認されます。

アブレーション後の細胞体のイメージングには、[チャンネル]メニューでDAPIトラックのクリックを解除してアブレーションレーザーを非アクティブ化し、取得モードメニューを開きます。[ズーム]をクリックし、ズームを 0.7 に減らします。

細胞アブレーションの成功を評価するには、視野を高速スキャンします。プリアブレーションイメージングと同じ設定を使用して、アブレーション後の画像をキャプチャして保存します。透過光光電子増倍管チャネル画像を検査して、細胞の損傷をさらに確認します。損傷した細胞は粒状の外観を示し、核は頻繁に膨張したり、形状が不規則に見えたりします。

アブレーション後の細胞体の回復を評価するには、タイムラプス画像キャプチャのステージ位置と時間オプションの両方をアクティブにし、時間パラメータを適切な実験時点と15分間隔に設定します。次に、実験を開始して画像を取得し、完了したら結果のファイルを保存します。