マウス大腸筋神経叢における腸内ニューロンとグリア活性のカルシウムイメージング

腸ニューロンとグリア細胞のネットワークで構成される神経節化神経叢を収容する固定化されたマウス結腸筋神経叢組織を含むイメージングチャンバーを取ります。

これらの細胞は、カルシウム結合時に蛍光を発するカルシウム指示薬で標識されています。

次に、チャンバーを蛍光顕微鏡ステージに置きます。イメージング中の筋肉の収縮を抑制するために、阻害剤を含む予熱されたバッファーでチャンバーを灌流します。

顕微鏡を使用して、均一な蛍光を示す健康な神経節領域を特定します。

蛍光画像を取得してベースライン活性を測定し、細胞内カルシウムレベルの基準を提供します。

容体アゴニストで組織を灌流してニューロン受容体を活性化し、細胞内カルシウムの流入と蛍光強度の増加を引き起こします。

ニューロンの活性化は周囲のグリア細胞を間接的に刺激し、カルシウムの流入とそれに続く蛍光の増加につながります。

タイムラプス蛍光画像をキャプチャして、ベースラインレベルに対するニューロンとグリア細胞の両方のカルシウム動態とシグナル伝達活性を示す蛍光強度の変化を測定します。

インキュベーション中に、プロトコルの書面部分の指示に従って修飾されたクレブバッファーを作成し、3マイクロモルのニカルジピンと1マイクロモルのスコポラミンを添加して、カルシウム2プラスのイメージング中の筋肉収縮を阻害します。記録チャンバーを蛍光顕微鏡下に配置し、複数の加熱シリンジリザーバーを備えた重力流灌流システムを使用して、摂氏37度クレブバッファーの毎分2〜3ミリリットルの連続灌流速度を確立します。真空トラップに接続された吸引ラインの両方に気泡が発生しないようにしてください。明視野照明の下で目的の神経叢に焦点を合わせます。光退色につながる可能性のある組織の露出しすぎは避けてください。

神経節内の蛍光色素負荷を調べ、イメージングのために健康な神経節を選択します。不健康な損傷した神経節は自家蛍光または点状の形態を示すため、イメージングには使用しないでください。神経節を選択したら、光路をカメラに迂回させ、画像取得ソフトウェアでライブ画像を取得します。神経節に焦点が合っていることを確認し、画像取得速度と露光時間を設定します。

画像取得速度と時間は、調査員が記録したいイベントによって異なります。ほとんどの実験では、グリアカルシウム過渡現象はカルシウム過渡ニューロンほど速くないため、グリア細胞の場合は0.5〜1ヘルツ、ニューロンの場合は最大2〜10ヘルツで画像が取得されます。

記録を開始し、実験刺激がない場合に選択した神経節のベースラインの生理学的活動を 30 秒間確立します。次に、受容体アゴニストやアンタゴニストなどの予熱された目的の薬物を、重力流灌流システムを使用して、薬物に最適化されたプロトコルに従って毎分2〜3ミリリットルの速度で適用します。録画を停止し、実験のタイムラプス動画を視聴します。

適切な画像解析ソフトウェアを使用して、関心領域 (ROI) を慎重に選択します。

最後に、適切なイメージングソフトウェアを使用して、関心領域の蛍光強度を正規化し、初期ベースライン値と比較します。正規化蛍光の変化は、カルシウムの変化に正比例します。