ショウジョウバエの脳をマトリックスに埋め込むことで、概日時計ニューロンのタイムラプスイメージングが可能

ウジョウバエの幼虫の脳を含むペトリ皿の蓋から始めて、明暗サイクルに予らしけます。このスライスには、蛍光タンパク質を発現する時計ニューロンが含まれています。

ニューロンの生存をサポートする抗生物質を含む栄養豊富な培地と、温かいフィブリノーゲン溶液を加えます。

溶液を穏やかに混合して、フィブリノーゲンを均一に分配します。

この混合物をガラス底皿のカバーガラスの上に少量置きます。

トロンビンを加えてフィブリノーゲンと反応させ、3次元フィブリンマトリックスの形成を誘導します。

脳をこのマトリックスに移し、前側を下にして、クロック ニューロンを整列させてイメージングします。

マトリックスを脳の上に折りたたんで固定し、動きを防ぎます。

栄養豊富な培地を加えてトロンビン活性を不活性化します。

ガス透過性メンブレンで皿を密閉して、水分補給とニューロンの生存率を維持します。

特定の間隔でタイムラプス蛍光イメージングを実行します。

時計ニューロンの蛍光変化は、明暗サイクルと同期したリズミカルな活性化と抑制を明らかにし、概日リズム、つまり日常の活動サイクルを反映しています。

脳を作業溶液に移した後、脳と培地を滅菌シャーレの蓋に分注します。次に、さらに3.5マイクロリットルのSAMと抗生物質を加え、3.5マイクロリットルの温かいSAMとフィブリノーゲンを加えます。

この手順全体を通して、フィブリノーゲンを含むSAM培地を37度に維持することが重要です。

次に、同じピペットチップで穏やかにピペッティングして脳の周囲に溶液を混合し、2マイクロリットルの溶液を吸引して、ガラス底皿のカバーガラスに堆積させます。次に、0.8マイクロリットルのトロンビンを液滴に加え、非常に迅速に混合して重合を初期化し、白く見えます。次に、鉗子を使用して脳をそっと摘み取り、重合フィブリンマトリックスに置きます。

脳が液滴に移された後にトロンビンを追加します。手順が非常に複雑になるため、お勧めできません。

必要に応じて脳の向きを合わせ、脳をカバーガラスにできるだけ近づけます。次に、重合したフィブリンの層を選び、マトリックスを剥がさない小さく穏やかな動きを使用して、脳の上に折ります。脳を安定させるために、血栓のさまざまな部分から脳上に重合したフィブリンの層を折りたたみ続けます。次に、埋め込まれた脳に抗生物質を含む20マイクロリットルのSAMを沈着させ、トロンビン活性を停止します。次に、培地の上にPTFE膜を置き、膜の端を皿のグリースを塗った部分に貼り付けます。