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神経変性マウスモデルの脳切片から始めます。
界面活性剤を添加したブロッキング溶液でインキュベートして、組織透過性を高め、非特異的結合をブロックします。溶液を破棄します。
アミロイドベータプラークを標的とする一次抗体を導入します。抗体がアミロイドベータプラークと相互作用するように撹拌しながらインキュベートし、洗浄します。
赤色蛍光色素タグ付き二次抗体を加え、暗所でインキュベートして抗体が相互作用できるようにします。
結合していない抗体を洗浄して除去し、続いてアルコール洗浄を行います。
βシートに富むアミロイドを親和性の高いクルクミンを加えて洗浄します。
次に、アルコール濃度を上げて治療し、脳の部分を脱水します。キシレンを加えて、試薬の痕跡をすべて除去します。
スライド上に切片を取り付け、蛍光顕微鏡で観察します。
590ナノメートルの波長レーザーを使用して、二次抗体上の赤色蛍光色素を励起します。画像をキャプチャします。
480ナノメートルの波長レーザーに切り替えてクルクミンを励起し、緑色の蛍光を発します。
画像を重ね合わせます。赤と緑の蛍光の共局在により、脳組織内のアミロイドベータプラークが確認されます。
クライオスタット切片検体を抗Aベータ抗体で標識するには、12ウェルプレートの個々のウェルで洗浄ごとにサンプルを新鮮なPBSで3回洗浄してから、PBS中の10%正常ヤギ血清および0.5%Triton x-100で非特異的結合を室温で1時間ブロックします。
インキュベーションの最後に、ブロッキング溶液を廃棄し、サンプルをAベータ特異的抗体とともに摂氏4度、毎分150回転で一晩インキュベートします。翌朝、洗浄ごとに新鮮なPBSで10分間の洗浄を3回行い、続いて、赤色蛍光色素と結合した適切な二次抗体と光から保護された室温で1時間インキュベートします。
インキュベーションの最後に、切片をPBSで3回洗浄し、続いて70%アルコールで1回洗浄します。アルコール洗浄後、切片を10マイクロモルクルクミンとともに室温で10分間インキュベートし、続いて3回、1分間70%アルコール洗浄します。
最後の洗浄後、90%および100%アルコールで濃度ごとに1分間切片を脱水し、インキュベーションごとに新鮮なキシレンとの浸漬ごとに5分間、切片を2回除去します。次に、図のようにセクションをマウントしてイメージ化します。