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$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
脊髄運動ニューロンに緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するトランスジェニックマウス胚から化学的に固定および除去された組織セグメントを採取します。
組織を改造したピペットチップに垂直に取り付けます。
ライトシート蛍光顕微鏡内に固定された毛細管に先端を取り付けます。
バッファーで満たされたサンプルチャンバーを組織の下に配置して、組織を浸し、破片を取り除きます。
イメージングソフトウェアを使用して、組織を光路に整列させます。
画像取得を開始します。
光源はレーザー光の薄いシートを放出し、組織の単一平面でGFPを励起して蛍光を発します。
光路に垂直に配置された検出器は、放出された蛍光を捕捉します。
脊髄運動ニューロンの画像を取得して、軸索分岐形態の3D再構成を生成します。
ソフトウェアを使用して軸索をマッピングし、分岐パターンとエンドポイントを特定して、運動ニューロンの成長と接続性を評価します。
5X/0.1 照明光学系と 5X/0.16 検出光学系をセットアップします。サンプルホルダーとサンプルキャピラリーを組み立てます。サンプルチャンバーに透明化溶液を充填して準備します。胚を取り付けるには、毛細管の直径に収まるように上部を切り取ってP200ピペットチップを準備し、サンプルを取り付けるための尖った部分を取り外します。
次に、小さな炎を使用してピペットチップの鈍い端を溶かします。炎を消し、溶けた端に胚を垂直にすばやく取り付けます。ピペットチップの上部をサンプルキャピラリーに合わせ、準備したサンプルチャンバーを顕微鏡に入れます。イメージングソフトウェアを使用して、[Locate]タブの[Locate Capillary]を選択し、xy軸とz軸を調整します。
次に、サンプルの検索を選択し、0.6倍にズームして胚に焦点を合わせます。チャンバーバッファーを胚としばらく平衡させて、破片や気泡を取り除きます。[取得]タブで画像取得を行うには、検出対物レンズ、レーザーブロッキングフィルター、ビームスプリッター、カメラ、レーザーなどの光路パラメータを定義します。
ピボットスキャンチェックボックスにチェックを入れて、影を減らします。次に、取得設定を定義し、ビット深度を16ビットにします。0.36〜0.7倍の片面照明または両面照明の範囲にズームします。[連続]をクリックし、レーザー強度、露光時間、レーザー出力、およびライトシートの位置を設定します。その後、停止を押して画像取得を終了します。
個々の運動神経の微細な直立構造の画像を詳細に取得できるように、透明なサンプルが最短の光路内に配置されていることを確認することが重要です。
多次元取得の場合は、最初と最後の画像のZ位置を移動してZスタックを定義します。[最適] をクリックして、スライス番号を設定します。次に、[実験の開始] をクリックして、選択した Z スタックを取得します。完了したら、画像をドットCZI形式で保存します。
軸索の樹枝化を定量化するには、画像解析ソフトウェアで画像ファイルを開きます。ディスプレイ調整ウィンドウを使用して画像の色、明るさ、コントラストを調整し、局所的な強度のコントラストに基づいてフィラメントを検出します。次に、[新しいフィラメントの追加] アイコンをクリックし、ドロップダウン メニューで自動パス アルゴリズムを選択します。関心のある地域を選択します。
次に、スライス モードを使用して測定できる最大直径と最も薄い直径の測定値を割り当てて、開始点とシード点を定義します。対象領域のエッジに始点を割り当てます。始点を手動で追加または削除するには、まずポインタ モードを変更し、[選択をナビゲート]に移動してから、対象点を Shift キーで右クリックします。
次に、[シード ポイントの手動しきい値]を選択して、目に見えるすべての樹木がマークされていることを確認します。次に、シードポイントを手動で追加または削除します。[切断されたセグメントを削除]チェックボックスをオンにして、始点の周りのシードポイントを削除します。その後、背景減算のしきい値を調整し、プロセスを終了します。
正確な定量化のためには、バックグラウンドアーティファクトを除去し、検出器経路が真の軸索樹枝化を反映していることを確認する必要があります。
最後に、希望のスタイルと色を選択します。[統計]タブで[詳細]を選択し、フィラメント番号樹状突起端子を使用して、運動軸索の樹枝形成の指標として運動神経終末を定量化します。次に、再構成された軸索の画像を としてエクスポートします。TIFF ファイル。