ライトシート蛍光顕微鏡による運動ニューロンの投射と軸索分岐の可視化

脊髄運動ニューロンに緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するトランスジェニックマウス胚から化学的に固定および除去された組織セグメントを採取します。

組織を改造したピペットチップに垂直に取り付けます。

ライトシート蛍光顕微鏡内に固定された毛細管に先端を取り付けます。

バッファーで満たされたサンプルチャンバーを組織の下に配置して、組織を浸し、破片を取り除きます。

イメージングソフトウェアを使用して、組織を光路に整列させます。

画像取得を開始します。

光源はレーザー光の薄いシートを放出し、組織の単一平面でGFPを励起して蛍光を発します。

光路に垂直に配置された検出器は、放出された蛍光を捕捉します。

脊髄運動ニューロンの画像を取得して、軸索分岐形態の3D再構成を生成します。

ソフトウェアを使用して軸索をマッピングし、分岐パターンとエンドポイントを特定して、運動ニューロンの成長と接続性を評価します。

5X/0.1 照明光学系と 5X/0.16 検出光学系をセットアップします。サンプルホルダーとサンプルキャピラリーを組み立てます。サンプルチャンバーに透明化溶液を充填して準備します。胚を取り付けるには、毛細管の直径に収まるように上部を切り取ってP200ピペットチップを準備し、サンプルを取り付けるための尖った部分を取り外します。

次に、小さな炎を使用してピペットチップの鈍い端を溶かします。炎を消し、溶けた端に胚を垂直にすばやく取り付けます。ピペットチップの上部をサンプルキャピラリーに合わせ、準備したサンプルチャンバーを顕微鏡に入れます。イメージングソフトウェアを使用して、[Locate]タブの[Locate Capillary]を選択し、xy軸とz軸を調整します。

次に、サンプルの検索を選択し、0.6倍にズームして胚に焦点を合わせます。チャンバーバッファーを胚としばらく平衡させて、破片や気泡を取り除きます。[取得]タブで画像取得を行うには、検出対物レンズ、レーザーブロッキングフィルター、ビームスプリッター、カメラ、レーザーなどの光路パラメータを定義します。

ピボットスキャンチェックボックスにチェックを入れて、影を減らします。次に、取得設定を定義し、ビット深度を16ビットにします。0.36〜0.7倍の片面照明または両面照明の範囲にズームします。[連続]をクリックし、レーザー強度、露光時間、レーザー出力、およびライトシートの位置を設定します。その後、停止を押して画像取得を終了します。

個々の運動神経の微細な直立構造の画像を詳細に取得できるように、透明なサンプルが最短の光路内に配置されていることを確認することが重要です。

多次元取得の場合は、最初と最後の画像のZ位置を移動してZスタックを定義します。[最適] をクリックして、スライス番号を設定します。次に、[実験の開始] をクリックして、選択した Z スタック