0 閲覧数 • 3:34 分 • May 29th, 2025
平らな脳皮質セクションの事前に固定された接線セクションから始めます。洗浄して固定剤の痕跡を除去します。
ジアミノベンジジンまたはDABと硫酸ニッケルアンモニウムの溶液で切片を染色します。
DABは皮質ニューロンに拡散し、ミトコンドリアのシトクロムオキシダーゼと反応して暗い沈殿物を形成します。硫酸ニッケルアンモニウムは沈殿物を暗くし、コントラストを高めます。
パラホルムアルデヒドを加えて染色反応を止め、すすぎます。
切片をスライドに取り付け、エタノール洗浄液で脱水します。
イソプロパノールとキシレンですすぎ、切片をきれいにし、光透過率を改善します。
封入剤を塗布し、その上にカバーガラスを貼ります。
明視野顕微鏡で画像化すると、皮質ニューロン内で沈殿物が光を吸収して散乱し、暗く見えます。
対照的に、汚れていないクリアな領域は光を透過し、明るく見えます。
このコントラストは、皮質モジュールが明るい背景に対して暗く斑状の構造として強調され、感覚情報の処理に関与する活発な神経クラスターを表しています。
切片組織をHEPESバッファーで15分間洗浄し、穏やかに攪拌します。洗浄中に、新鮮なシトクロムオキシダーゼ染色液を調製し、使用直前にDAB成分を加えます。次に、作りたての染色液中で切片をシェーカーで室温でインキュベートします。そして、見守ってください。固定の量によっては、染色が10分で観察されることもあれば、数時間かかることもあります。
反応が遅すぎる場合は、温度を摂氏37度に上げます。反応を止めるには、切片を4%PFAの浴に移し、穏やかに攪拌しながら15分間インキュベートします。次に、切片をHEPESバッファーで1回10分間洗浄する。
次に、スライドガラスに切片を取り付けて乾燥させ、徐々に強くなるエタノール浴を使用して脱水します。次に、スライドをイソプロパノールで5分間洗浄し、続いてキシレンで5分間洗浄します。キシレン浴の後、すぐに急速硬化の非水性封入剤を追加します。水性媒体は汚れを劣化させます。カバーガラスを追加した後、スライドを画像化するまで摂氏4度で保存します。