形質導入マウス胚脳切片における皮質ニューロン放射状移動のタイムラプスイメージング

形質導入されたマウス胚の器官型脳スライスを含むメンブレンインサートを取り、ニューロンと放射状グリア細胞が蛍光タンパク質を発現し、それらの視覚化を可能にします。

蛍光顕微鏡を使用して、無傷の放射状グリア足場を使用して、蛍光皮質ニューロンがスライスの軟膜表面に向かって放射状に移動するスライスを選択します。

選択したスライスを含むメンブレンインサートを、イメージング中の細胞活動をサポートするために培地を含むガラス底皿に移します。

細胞の生存率を確保するために、皿を倒立共焦点顕微鏡の気候制御チャンバーに入れます。

イメージングパラメータを調整して、光損傷を最小限に抑えながら鮮明な画像をキャプチャします。

次に、ターゲット領域にZスタックを設定して、細胞構造を視覚化します。

定期的にタイムラプスイメージングを開始します。

画像を分析して、脳室下ゾーンから放射状グリア足場に沿った皮質プレートへの皮質ニューロンの放射状移動を評価し、ニューロンの移動パターンを強調します。

倒立顕微鏡でスライスを観察して、イメージング用の脳スライスを選択します。上部SVZに明るい単一ニューロンがあり、スライスの軟膜表面に向かって放射状に移動するスライスを選択します。

皮質板全体にまたがる放射状グリア細胞の微細な蛍光突起の存在は、移動する皮質ニューロンによって使用される無傷の放射状グリア足場を示しています。

選択したスライスを含むメンブレンインサートを、2ミリリットルのスライス培地を含む直径50ミリメートルのガラス底皿に移します。皿を共焦点顕微鏡の気候室に入れます。

解像度を 512 x 512 ピクセルに設定します。スキャン速度を400ヘルツから700ヘルツに上げて、フレームレートを毎秒約1.4フレームから約2.5フレームに上げます。平均化は2回以下で使用してください。

エレクトロポレーション領域を通るZスタックを1.5ミクロンのステップサイズで定義します。タイムラプスシリーズは、30分ごとにZスタックを取ることから始めます。説明されている設定により、取得中の光損傷を低く保ちながら、画像の十分な解像度と明るさが可能になります。