0 閲覧数 • 3:16 分 • May 29th, 2025
オリゴデンドロサイトに分化するように誘導された、ラットの子犬の脳から単離されたオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)の培養を取ります。細胞構造を維持するためにセルは固定されています。
分化したオリゴデンドロサイトは、成熟オリゴデンドロサイトのマーカーであるミエリン塩基性タンパク質(MBP)を発現しますが、OPCと分化した細胞の両方がオリゴデンドロサイト転写因子2(Olig2)を発現します。
透過処理ブロッキング溶液を塗布し、撹拌でインキュベートし、細胞膜を透過処理し、非特異的結合部位をブロックします。
マーカーを標的とする一次抗体を加え、撹拌しながらインキュベートして結合させます。
洗浄して結合していない抗体を除去し、一次抗体に特異的な異なる蛍光色素結合二次抗体を加え、撹拌しながらインキュベートします。
細胞を洗浄し、デュアル蛍光イメージングシステムに入れます。
特定の波長の光を使用して、異なる蛍光色素を励起し、放出されたシグナルを検出してマーカーを視覚化します。
olig2のみを発現する未分化OPCのうち、olig2とMBPを発現する分化オリゴデンドロサイトを同定します。
プレートを室温に戻します。ウェルを吸引し、5%NGSおよび0.1%Triton X-100を含む250マイクロリットルのDPBSを加えます。プレートを室温で1時間インキュベートし、穏やかな軌道振とうします。マウスモノクローナル抗MBP抗体とウサギポリクローナル抗OLIG2抗体を5%NGSを含むDPBSで希釈することにより、一次インキュベーション溶液を調製します。次に、一次抗体を摂氏4度で一晩16〜18時間、穏やかな眼窩振とうしながらインキュベートします。
プレートを洗浄しながら、抗マウス680抗体と抗ウサギ800抗体を5%NGSを含むDPBSで希釈して二次インキュベーション溶液を調製します。次に、最終洗浄液を吸引し、250マイクロリットルの二次インキュベーション溶液を加えます。プレートを光から保護し、穏やかな軌道振とうで室温で1時間インキュベートします。
その後、700ナノメートルと800ナノメートルの蛍光発光を検出できるイメージングシステムを使用してプレートをスキャンします。開始点として、焦点オフセットを 3 に設定し、感度を MBP の場合は 1.5、アクチンの場合は 5.0、OLIG2 の場合は 3.5 に設定します。信号の露出オーバーを避けるために、必要に応じて感度値を調整します。