近赤外蛍光と高分解能スキャニングを用いたげっ歯類脳におけるタンパク質発現の測定

扁桃体ニューロンのAMPAおよびNMDA受容体について免疫染色されたラット脳組織切片を含むスライドガラスを取ります。

AMPA 受容体は、グルタミン酸誘発性ナトリウム流入と高速興奮性シナプス伝達を媒介します。

対照的に、NMDA 受容体はグルタミン酸およびコアゴニスト誘発性ナトリウムおよびカルシウム流入を媒介し、ゆっくりとした興奮性シナプス伝達を促進します。

受容体は一次抗体で染色され、近赤外蛍光色素タグ付き二次抗体を使用して検出されます。

スライドのティッシュ側を下にして、近赤外線スキャンインターフェースに置きます。

イメージングパラメータを調整し、イメージングを開始します。

レーザー照射すると、AMPAおよびNMDA受容体の蛍光色素が蛍光を発します。

近赤外イメージングは自家蛍光を最小限に抑え、信号の明瞭さを高めます。

高解像度スキャンにより、蛍光シグナルの明確な区別がさらに保証され、扁桃体の近くの AMPA および NMDA 受容体の正確な視覚化が可能になります。

イメージングソフトウェアを使用して、学習と記憶のマーカーとして、特定の関心領域のAMPA / NMDA蛍光強度比を計算します。

スライドを近赤外スキャンインターフェースに、組織を下に向けて置きます。選択ツールを使用して、一度に複数のスライドを画像化します。21マイクロメートルの解像度で最高品質の設定を使用してスライドを画像化します。0ナノメートルのオフセットで、画像を画像解析ソフトウェアにインポートして、半定量的タンパク質分析のために表示およびマークします。

画像解析ソフトウェアを開いた後、画像をスキャンした作業領域を選択します。次に、スキャンした画像を画像解析ソフトウェアで開いてスキャンを表示し、生の画像や定量化された総放射を変更せずに、表示される波長、コントラスト、明るさ、倍率を調整します。

定量化の主要な領域を特定したら、ページ上部の[分析]タブを選択し、[長方形の描画]を選択して、定量化する領域に長方形を描画します。長方形のサイズを表示するには、画面の左下にある [図形] を選択します。次に、右下の [列] を選択します。次に、高さ列と幅列を追加して、図形のサイズを識別します。最後に、図形に名前を付けて繰り返します。すべての領域がサンプリングされたら、[列] タブから使用可能なデータの結合と分析に進みます。