神経ペプチドに対するショウジョウバエの脳応答を研究するための Ex vivo カルシウムイメージング

細胞機能を維持するためにバッファーに沈められた固定化されたショウジョウバエ脳外植片を含むイメージングチャンバーから始めます。

脳内のニューロンは、カルシウムイオンに結合して蛍光を発する細胞質蛍光カルシウム指示薬を発現します。

イメージングチャンバーを水浸レンズを備えた蛍光顕微鏡の下に置きます。

レンズを下げ、明視野照明の下で脳に焦点を合わせます。

蛍光モードに切り替えて、画像をキャプチャします。

次に、ニューロペプチドをバッファーに導入し、タイムラプス記録を開始します。

神経ペプチドはニューロン上の受容体に結合し、細胞内シグナル伝達を引き起こします。これにより、カルシウムチャネルが開き、カルシウムイオンの流入が可能になります。

これらのカルシウムイオンは指示薬に結合し、蛍光強度を高めます。

神経ペプチド刺激後の画像の再取得

神経ペプチド刺激前後の画像を比較します。

神経ペプチド刺激後の蛍光強度の増加は、神経ペプチドシグナル伝達に対するショウジョウバエの脳の反応を反映しています。

カルシウム蛍光画像を取得するには、脳外植片を含むイメージングチャンバーを顕微鏡下に置きます。対物レンズがPBSに触れるまで下げます。そして、明視野照明の下で、脳を配置して焦点を合わせます。

蛍光灯に切り替え、GCaMP6標識細胞の焦点を調整します。水冷モードで512 x 512ピクセルの解像度で、フレームあたり250ミリ秒で取得を開始します。次に、露光時間を調整して、CCDカメラのダイナミックレンジ内の蛍光値を取得しますが、16ビット画像で1,000任意の単位以上

を取得します。

イメージングパラメータが決定されたら、ペプチド投与の1分間画像を撮影して、ベースラインシグナル強度を検出します。続いて、調製したペプチド溶液100マイクロリットルを幼虫浴にピペッティングして、試験ペプチドを直接塗布します。GCaMP6 の放射を数分間記録します。