マウス脳切片における上衣細胞繊毛活性のライブイメージング

マウスの脳の矢状面を採取して、脳脊髄液(CSF)で満たされた空洞である心室を露出させます。

心室の内側を覆う上衣細胞は、CSFを推進して循環を促進する運動性繊毛を持っています。

毛

様体活動を維持するために、栄養豊富な培地を含むガラス底皿に切片を置きます。

ディッシュを示差干渉コントラスト(DIC)顕微鏡の気候制御チャンバーに移し、イメージング中の細胞生存率を維持します。

DIC 顕微鏡はプリズムを使用して偏光を分割し、さまざまな経路に沿って標本に向けます。

試験片全体の屈折率の変動により、ビーム間に位相差が生じます。

2 番目のプリズムがビームを再結合し、干渉を生成して 3 次元効果のある高コントラスト画像を生成し、微細構造の視認性を高めます。

鼓

動によって生成される気泡の動きを観察することにより、運動性繊毛を持つ機能性上衣細胞を見つけます。

高コントラストDICイメージングを使用して、繊毛を記録して鼓動周波数を定量化します。

切片を画像化するには、脳スライスを1ミリリットルの高グルコース培地を含む30ミリメートルのガラス底培養皿に入れ、60倍の対物レンズ油浸レンズを使用して、密閉された顕微鏡チャンバー環境を摂氏37度、二酸化炭素5%に調整します。

次に、通常のDIC透過光を持つセルに焦点を合わせます。次に、DMEMバブルの動きの方向に従って、運動性上衣繊毛の位置へのガイドとして、DICフィルターを使用して、脳の側脳室に運動性繊毛を持つ健康な細胞を含む領域を選択します。上衣繊毛が特定されたら、光を調整し、焦点を合わせて満足のいく画像を取得します。

次に、イメージングソフトウェアでライブイメージングパラメータを設定します。たとえば、ここでは、カメラのビニングを1×1に設定し、60倍の対物レンズと組み合わせ、5〜10ミリ秒の露光時間で、24ビット画像が取得されています。

顕微鏡の開口部を最適なレベルまで開き、露光時間を最小限に抑え、DIC画像を収集します。カメラにストリームされるライブ画像を観察して、遅延なく迅速かつ即時に画像取得を提供します。繊毛の鼓動速度は、十分な画像コントラストを得るための最小露光時間の要件に基づいて計算できます。