有髄マウス軸索におけるニューロフィラメント輸送の蛍光光活性化イメージング

倒立顕微鏡のステージ上に灌流アセンブリを配置することから始めます。

灌流アセンブリには、カバーガラスと連続生理食塩水灌流を備えたマイクロ水道スライドの間に固定された解剖された末梢神経が含まれています。

神経の有髄軸索は、緑色の蛍光色素タグ付きニューロフィラメントを発現します。

明視野照明を使用して、有髄軸索に焦点を合わせます。

共焦点モードに切り替え、高レーザー出力で光退色し、低レーザー出力を使用して低自家蛍光の参照画像をキャプチャします。

軸索に沿って平行線を描画して、光活性化ウィンドウの長さを定義します。これをガイドとして使用して、長方形の活性化領域を作成します。

この領域を特定の波長で照射して、緑色の蛍光色素タグ付きニューロフィラメントを活性化し、蛍光を発します。画像を取得します。

アクティブ化後、タイムラプス画像をキャプチャします。

時間が経つにつれて、蛍光ニューロフィラメントは両方向に移動し、隣接する側面領域に広がります。

活性化領域に隣接する側面領域に蛍光が現れることで、ニューロフィラメント輸送が確認されます。

神経の近位端をつかみ、カバースリップの上にゆっくりと置きます。次に、穏やかな張力でまっすぐにします。溝のあるスライドを下にしてマイクロ水道スライドを神経の上に置き、流れの方向を神経と平行に配置します。カバースリップとマイクロ水道橋アセンブリを裏返し、スライドを外側のガスケットと反対にして灌流チャンバーハウジングに置きます。

灌流室を固定するには、灌流室を金属製のハウジングに置き、ロックリングを回転させます。生理食塩水シリンジプランジャーをゆっくりと押し下げ、灌流室を満たします。セットアップ中およびイメージング中は、入口および出口チューブ、出口フラスコ、およびシリンジをチャンバー自体より常に高く保ちます。灌流アセンブリを倒立顕微鏡ステージに移し、生理食塩水シリンジをシリンジポンプに取り付けます。次に、モーターを始動し、毎分0.25ミリリットルの流量に速度を調整します。

インライン溶液ヒーターを接続し、摂氏37度に設定します。対物ヒーターを接続し、摂氏37度に設定します。対物レンズにオイルを塗布し、灌流室をステージマウントに挿入します。チャンバーヒーターパッドにオイルを塗布し、灌流チャンバーに取り付けます。次に、接続して摂氏37度に設定します。

灌流室をステージアダプターにロックし、対物レンズオイルをチャンバーの下側にあるカバースリップに接触させます。明視野照明を使用して、カバースリップ面に最も近い神経の底面にある軸索の層に焦点を合わせます。有髄軸索は、コントラスト増強なしで明視野透過光照明下で見えるミエリン鞘の存在によって識別できます。

明視野基準画像を取得し、神経の指向性を記録します。次に、488ナノメートルレーザーと光活性化可能なGFPに適した発光フィルターを使