マウスの子犬の神経形態をイメージングするための2光子顕微鏡法

、2光子顕微鏡の励起光をセットアップします。

円形のガラスイメージングウィンドウと頭蓋骨にヘッドプレートを埋め込んだ麻酔をかけたトランスジェニックマウスの子犬を取ります。

ニューロンは、イメージングを容易にするために赤色蛍光タンパク質を発現します。

ガラスのイメージングウィンドウを掃除し、子犬を2光子イメージングステージに固定します。

子犬の頭を調整して、イメージングウィンドウを顕微鏡の対物レンズに合わせます。

子犬の体温を維持するために温熱パッドを使用してください。

麻酔の流量を調整します。

カバーガラスに水を一滴垂らし、顕微鏡の対物レンズを下げます。

二光子顕微鏡は、2 つの光子の光を使用して蛍光タンパク質を活性化し、バックグラウンド ノイズと光退色を最小限に抑えた詳細なニューロン イメージングを可能にします。

さまざまな深さでニューロンの画像をキャプチャして、その構造を視覚化します最後に

、画像を積み重ねて、ニューロンの投影を含むニューロンの 3 次元表現を生成し、成長に関連した形態学的変化を研究します。

イメージングを開始するには、まず2光子レーザーの波長を設定します。RFP励起には、1,000ナノメートルの波長を使用します。カバースリップの表面を70%エタノールで拭きます。麻酔をかけた子犬をチタンバーを使用してイメージングステージのチタンプレートに取り付けます。ゴニオメーターステージを使用して、カバースリップが対物レンズと平行になるようにヘッドを調整します。

ング中は、摂氏37度に設定された加熱パッドを使用して子犬の体温を維持し、イソフルラン濃度を0.7%から1%に下げます。イメージングステージを2光子顕微鏡の20倍対物レンズの下に置きます。カバースリップに水を1滴垂らします。

1.4ミクロン間隔でzスタック画像を取得するようにソフトウェアを設定します。レイヤー4ニューロンイメージングの場合、z幅を150〜300ミクロンに設定して、樹状突起の形態全体を画像化します。低速スキャンと平均化を使用して、ニューロンの形態を示す鮮明な画像を取得します。

樹状突起の形態全体を取得するには、通常20分以上かかります。