JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 3:54 分 • May 29th, 2025
化されたトランスジェニックショウジョウバエを、蛍光顕微鏡ステージ上の記録チャンバーに頭を露出させた状態で固定します。
ハエのキノコ体は、カルシウム感受性生物発光融合タンパク質を発現するニューロンで構成されており、これは事前にロードされた補因子によって活性化されます。
灌流チューブをチャンバーに接続します。蛍光キノコの体を見つけて、がくと内葉に焦点を当てます。バッファーでドレナージを確認します。
イメージングパラメータを設定し、がくと内側葉に焦点を合わせます。暗闇の中で、覚醒剤曝露前にキノコ体のベースライン蛍光画像を取得します。
ニコチンをカルシウム含有緩衝液に灌流してニコチン性アセチルコリン受容体を活性化し、カルシウムの流入と生物発光
の発光を引き起こします。バッファーで洗浄してベースライン状態を復元します。
塩化カリウムを灌流してニューロンを脱分極し、細胞内カルシウムの放出と生物発光シグナル放出を引き起こします。
バッファーで洗浄してベースライン状態を復元します。
画像を解析して、がくと内葉の空間的および時間的カルシウム活性を評価します。
- 次に、サンプルを顕微鏡下のマウントに置き、倍率を5倍に調整します。次に、穿刺を通して灌流チューブをチャネルに挿入します。顕微鏡を蛍光モードに設定し、中央に合わせ、キノコの本体に焦点を合わせます。キノコの本体に焦点が合ったら、倍率を20倍に変更します。画像の中央に戻し、フォーカスを調整します。
次に、排水装置を排水プールの上に置き、先端が排水プールのすぐ上になるように排水シャントの高さを調整します。次に、サンプルをリンゲル液で 30 秒間洗い流し、適切な排水を確認します。最後に、シールドを引き下げて、装置を外光から密閉します。
Photon Imagerプログラムの自動化システムを使用して、焦点を微調整し、キノコ体の基準蛍光画像を撮影します。Controlキーを押しながらボックスをクリックし、所定の位置にドラッグして、がく、細胞体、および内葉上の関心領域ボックスの位置を調整します。
次に、ベースライン値を約5〜10分間記録します。次に、スイッチをオンにしてニコチンの流れを開始します。同時に、Enter キーを押して、ニコチンの流れが始まったことを示すメモを追加します。1 分後にフローを停止し、フローが停止したことを示す別のメモをログに作成します。次に、サンプルをリンゲル液で5分間洗浄します。
サンプルが回復する間に、洗浄をオフにし、タイマーをさらに5分間設定して、塩化カリウムの流れを開始する準備をします。開始する準備ができたら、塩化カリウムの流れを開始し、サンプルログに100ミリモルの塩化カリウムの開始を入力します。1分後、流れを止め、塩化カリウムをシャットオフしてサンプルログに入力します。次に、サンプルをリンゲル液で1分間洗浄し、顕微鏡を蛍光モードに切り替えます。最終的な蛍光画像を撮影し、リンゲル液をオフにしてサンプルを取り出します。