線虫ニューロンにおけるPolyQタンパク質凝集の蛍光寿命イメージング

麻酔をかけた年齢が一致した対照およびシャペロン欠損のエレガンス線虫から始めます。

どちらのグループも、誤って折り畳みやすいニューロンで蛍光色素タグ付きpolyQタンパク質を発現します。

対照ワームでは、シャペロンタンパク質は誤って折りたたまれたpolyQ凝集を制限しますが、シャペロン欠損ワームでは、誤って折りたたまれたpolyQは容易に凝集体を形成します。

FLIM(Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)用の共焦点顕微鏡ステージにコントロールスライドを置きます。

パルスレーザーを使用してワームを照射します。

レーザーは蛍光色素を励起し、蛍光色素は基底状態に戻るときに光子を放出します。

FLIMは、蛍光寿命(蛍光色素が励起状態にとどまる時間)を測定します。

シャペロン欠損ワームでは、polyQ凝集体が蛍光色素をクラスター化し、光子放出の代わりに隣接する蛍光色素間のエネルギー移動を促進し、それによって蛍光寿命を短縮します。

FLIMソフトウェアはこれらの寿命を処理して色分けされたマップを生成し、凝集の視覚化を可能にします。

対照と比較して、シャペロン欠損ワームの蛍光寿命の短縮は、polyQ凝集の増加を示しています。

線虫が完全に動かないことを確認してください。FLIM集録ソフトウェアを開きます。タブボタンを見つけて、出力の有効化を押します。マウントされたスライドをステージ上に置き、透過モードで10倍の倍率レンズを使用して、スライド上の線虫の位置を特定します。スライドを取り外し、対物レンズを63倍の倍率レンズに切り替え、必要な浸漬媒体を塗布します。

スライドをステージに置き、線虫の位置を特定します。サンプルのスキャンを開始します。関心領域を選択し、その最大投影面に焦点を合わせます。FLIMソフトウェアのインターフェースで、検出された光子の数をプレビューします。ADC値は、4番目から10倍、5番目から10倍の間である必要があります。必要に応じて、焦点を別の平面に移すか、レーザー出力を上げてより多くの光子を収集します。

- 光子の積み重ねは避けますが、十分な量の光子を集めて、良好な寿命のフィット感と測定を作成します。

- メニューバーで、取得パラメータを設定するタブを選択します。[スキャン同期]を選択して、単一光子検出を許可します。取得を一定の時間または固定数のフォトンに設定します。[開始]を押して、取得を開始します。ソフトウェアを開き、ファイル、FLIMデータのロードからFLIMデータファイルをインポートします。異なるセッションや異なる生物学的反復から得られた場合でも、1つの条件からすべてのサンプルをロードします。

必要に応じて、セグメンテーション、セグメンテーションマネージャーを使用して、多くのFLIM画像に対して単一の線虫をセグメント化します