筋萎縮性側索硬化症のIn Vitroモデルにおけるシナプスカルシウムダイナミクスの蛍光イメージング

培地を含むコーティングされたガラス底皿で培養した初代げっ歯類皮質ニューロンを取ります。

これらの細胞は、遺伝的にコードされたALS関連タンパク質とカルシウムバイオセンサーを発現します。

培地を低カリウム塩化物バッファーと交換します。

静時のニューロン活動とベースラインのカルシウムレベルを維持するためにインキュベートします。

皿を共焦点顕微鏡ステージに取り付け、灌流チューブを配置します。

明視野照明を使用して、ニューロンに焦点を合わせてから、蛍光イメージングに切り替えます。

顕微鏡のレーザーを使用して、バイオセンサーを励起し、蛍光発光を記録して、ベースラインの細胞内カルシウムレベルを決定します。

次に、高塩化カリウム緩衝液で皿を灌流します。

カリウム濃度が高いとニューロンが脱分極し、シナプス前終末で電位依存性カルシウムチャネルが開きます。これにより、カルシウムの流入が可能になり、ニューロンのシナプス活動が開始されます。

増加した細胞内カルシウムはバイオセンサーに結合し、コンフォメーション変化を引き起こして蛍光を高めます。

蛍光の記録を続けて細胞内カルシウムレベルのリアルタイム変化を測定し、ニューロンのシナプス活動を明らかにします。

GCaMP6mによるトランスフェクションの48時間後、初代げっ歯類の皮質ニューロンを低塩化カリウムACSFで15分間インキュベートします。次に、ディッシュをイメージングプラットフォームに取り付け、FITCフィルターと20倍または40倍の対物レンズを使用してGCaMP6m蛍光を視覚化します。イメージングフィールドを選択し、完璧な焦点を合わせた後、明視野FITCと蛍光マーカーチャネルを使用して単一の静止画像を撮影し、ニューロンの境界をマークします。

次に、取得ソフトウェアで「今すぐ実行」を開始し、3〜5分間基礎記録を実行します。次に、前述のように50ミリモルの塩化カリウムを含むACSFをニューロンに灌流し、5分間記録します。画像取得が停止したら、実験を保存し、共焦点ソフトウェアを使用したデータ解析に進みます。

画像解析の場合は、タイムラプス画像と共焦点ソフトウェアを開き、[画像]、[処理]、[現在のドキュメントの整列]の順にクリックして画像を整列させます。次に、最初のフレームに整列を選択します。ROI選択ツールを使用して神経突起に沿って関心領域を選択し、バックグラウンド蛍光強度を表すROIもマークします。次に、時間測定パネルから測定機能を開始し、選択したROIの経時的な生の蛍光を測定します。測定後、生の蛍光強度をスプレッドシートソフトウェアにエクスポートします。