ゼブラフィッシュ幼生の脳のin vivoイメージングによる小脳ニューロンの可視化

酔をかけたトランスジェニックゼブラフィッシュの幼虫を、酸素化生理学的緩衝液を含む取り付けチャンバーで実体顕微鏡下で開始します。

脳内の小脳には、蛍光細胞質タンパク質を発現する遺伝子組み換えプルキンエニューロンが含まれています。

余分な培地を除去し、溶融アガロースを加えて幼虫を固定化し、安定したイメージングを実現します。

幼虫の背側を上に向けて、小脳を視覚化します。

固まったら、余分なアガロースをトリミングします。ガラス針を使用して、脳を覆う色素沈着した皮膚を切除して露出させます。

ガロースブロックを溶融アガロースを含むイメージングチャンバーに裏返し、倒立顕微鏡でイメージングします。

ニューロンの機能を維持するために生理学的バッファーを追加します。

チャンバーを倒立共焦点顕微鏡の下に配置します。励起光を照射して蛍光タンパク質を励起し、標識ニューロンの視覚化を可能にします。

沈着した皮膚細胞は、除去しないと励起光を散乱して吸収し、蛍光強度を低下させます。

皮膚を除去すると、光の透過性が向上して蛍光強度が高まり、ニューロンの視覚化が促進されます。

幼虫を埋め込むには、パスツールピペットを使用して、麻酔をかけた幼虫を実体顕微鏡下の取り付けチャンバーに移します。幼虫がまだ動けない場合は、魚が完全に動けなくなるまで、実験に魚を使用しないでください。幼虫が動かない場合は、余分な培地を慎重に取り除き、すぐに少なくとも1ミリリットルの低融点アガロースを幼虫に加えます。

ゼブラフィッシュの背側を上に向けて、アガロースの表面にできるだけ近づけます。幼虫を倒立顕微鏡で画像化する場合は、固化後、幼虫を含むアガロースを小さな直方体ブロックにトリミングします。画像診断のために脳を露出させるには、必要に応じて脳の関心領域上の余分なアガロースを取り除き、ガラス針を使用して、組織に深く浸透しすぎずに、関心領域の近くの皮膚を細かく切開します。

皮膚表面のすぐ下で針をかろうじて動かし、関心領域の上の皮膚を取り除くか脇に押しのけることができるまで、関心領域の周りに非常に小さな切り込みを慎重に行い続けます。組織がすべての胚から除去されたら、事前に準備された倒立顕微鏡のイメージングチャンバーに低融点アガロースの少量を加え、小さなスパチュラを使用して直方体のアガロースブロックをイメージングチャンバー内のアガロース滴に180度反転させます。アガロースが固まったら、イメージングチャンバーに新しいACSFを満たし、幼虫のイメージングを開始します。