JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 6:52 分 • June 17th, 2025
マウスの脳組織サンプルと標準をレーザーアブレーションチャンバーに入れます。
この標準には、子羊の脳組織ホモジネートにスパイクされた既知の濃度の金属が含まれています。
チャンバーをアルゴンガスで満たし、紫外線レーザービームを組織に集束させます。
レーザーはサンプルと標準物質を線形パターンで蒸発させ、微粒子のエアロゾルを作成します。
アルゴンガスは、粒子を高温イオン化源である誘導結合プラズマに運びます。
プラズマは粒子を霧化し、正に帯電したイオンにイオン化します。
イオンは質量分析計に入り、質量電荷比に基づいて分離されます。
得られたデータは参照データベースと比較され、サンプル中に存在する金属が特定されます。標準試料から検量線が生成されます。
サンプル中の金属濃度を標準物質の信号強度に対して校正することで、サンプル中の金属濃度を計算し、脳スライス内の金属の空間分布を明らかにします。
まず、脳組織サンプルとすべてのマトリックスが一致した組織標準をレーザーアブレーションチャンバーに入れます。サンプルがLACCDカメラの被写界深度内にあることを確認します。チャンバードアを閉じ、ネジを指で締めます。
次に、ICP-MSソフトウェアでキャリアガスバルブを開き、流量を毎分1.2リットルに設定します。LAソフトウェアで、2容量のアブレーションセルのキャリアガスでアブレーションセルを30分間パージします。10分ごとに、サンプルステージをチャンバーの各コーナーに移動して、セル内の残留空気の量を減らします。
ICP-MSの電源を入れ、装置を2時間ウォームアップします。器具がウォームアップしている間に、レーザーアブレーションソフトウェアで、最初の組織標準の表面に長さ約3ミリメートルのアブレーションの線を引きます。アブレーションの線をクリックし、デフォルトのビーム直径、スキャン速度、および放射フルエンスを設定します。線を 6 回複製し、線の間隔を梁の直径だけ間隔を空けます。標準ごとにこのプロセスを繰り返します。
次に、線ツールを使用して、標準と同じパラメーターを使用して、サンプルの左上隅からサンプルの最も広い点を横切ってサンプル上にアブレーション領域を描画します。
必要に応じて、標準で使用されているのと同じ間隔でサンプルを完全にカバーするために、ラインを複製します。次に、サンプルをスキャンしてから20時間後、または各サンプル間に、標準試料を断続的にスキャンするための一連の線を引きます。実験の最後に標準のスキャンを追加します。
ラインの長さとスキャン速度に基づいて、サンプルラインと標準ラインの分析時間を決定します。次に、ICP-MSソフトウェアで新しいバッチを作成し、時間分解分析を選択します。対象の質量電荷比の値を選択し、各比の積分時間を設定すると、1サイクルの合計積分時間が0.25秒になります。バッチを保存します。
標準バッチの場合、レーザーのウォームアップとウォッシュアウト時間を考慮して、各ラインの分析時間に追加の15秒のバッファーを入力します。各標準ラインの取り込みを含むサンプル実行リストを設定します。サンプルバッチの場合は、標準バッチを複製し、サンプルアブレーションパターンに応じて取得回数を調整します。
ICP-MS がウォームアップしたら、最初のバッチをキューに追加し、ソフトウェアが LA 装置からのトリガーを待機していることを確認します。次に、LAソフトウェアでレーザー電源をオンにし、レーザーのウォームアップとウォッシュアウトの時間を設定します。レーザーシーケンスを開始し、アブレーション後にICP-MSがデータ収集を正しく開始することを確認します。
データが収集されたら、CSV ファイルから標準のデータを抽出します。ベースライン減算を実行し、バックグラウンド信号を除外します。組織標準の穴によって引き起こされるシグナルドロップを特定します。
これらの低信号領域をマスクし、データをスプレッドシートとしてエクスポートします。識別された各要素について、CPSからPPMへの変換係数を計算します。標準ごとにこのプロセスを繰り返します。
次に、定量画像構築ソフトウェアを開き、CSVファイルからサンプルデータをインポートします。背景のいくつかの領域を選択して、背景補正を適用します。グラフ編集ツールを選択し、画像を右クリックして、[画像の外観の変更] を選択します。Z の最初の色を大きな負の値に変更します。
そしてクリック 完了 バックグラウンド信号を強化します。次に、[標準] タブで、各標準の CPS PPM 補正係数を入力し、[実行] をクリックします。[データ]タブでデータブラウザを開き、修正された画像ファイルを右クリックして、[新しい画像]をクリックします。
[イメージの外観を修正]ウィンドウを開き、カラー テーブルとスケールを設定します。注釈を追加ユーティリティを使用して、画像にカラースケールを配置します。カラースケールウィンドウでカラースケールを調整します。画像に色を付けて注釈を付けたら、画像をコピーして別のプログラムに貼り付けるか、画像構築ソフトウェアから画像をエクスポートします。
ROI ツールをアクティブにするには、解析パッケージから [画像処理] を選択し、画像を選択します。[画像] タブで [ROI] をクリックし、ROI Draw を開始します。対象領域を選択し、[ROI の完了] をクリックします。
[画像] タブで、[統計] をクリックして ROI データを取得します。データをコピーしてスプレッドシートに貼り付け、各 ROI が追加されたら必ず保存します。必要に応じてこのプロセスを繰り返します。