0 閲覧数 • 3:15 分 • June 17th, 2025
後生きたマウス網膜外植片をメンブレンフィルターに取り付け、共焦点顕微鏡下のインキュベーションチャンバーに入れることから始めます。
網膜をトランスフェクトしてスターバースト無軸介在ニューロンの膜に蛍光タンパク質を発現させる
事前に濡れたサンプルウェイトを網膜に置き、網膜を安定させます。
チャンバーをバッファーで満たします。
チャンバー内の最適なバッファーの流れと温度を維持し、ニューロンの生存率を維持します。
水浸対物レンズをイメージングチャンバーに配置します。
落射蛍光イメージングを開始します。
対物レンズを通るレーザー光は、無鎖細胞の蛍光タンパク質を励起します。
放出された蛍光は同じ対物レンズを通して捕捉され、標識された無鎖細胞の視覚化が可能になります。
イメージング用の明るい蛍光セルを特定します。
イメージングパラメータを設定します。
複数のZ平面で画像をキャプチャして、完全な樹状突起形態の3D視覚化を実現します。
タイムラプスイメージングを実行して、樹状突起の形態の経時的な変化を追跡します。
ライブイメージングインキュベーションチャンバーを組み立て、酸素化されたaCSFで満たします。ポンプと温度コントローラーの電源を入れ、温度が摂氏 34 度を超えないようにします。チャンバー温度が安定するまでに最大1時間かかる場合があります。網膜郭清を開始する前に、インキュベーションチャンバーをセットアップすることをお勧めします。安定したチャンバー温度は、サンプルのドリフトを減らすのに役立ちます。
網膜フラットマウンドを灌流室に移すには、ポンプを停止し、チャンバー内にあるaCSFを取り除きます。次に、網膜フラットマウントを備えたMCEディスクをインキュベーションチャンバーに入れます。サンプルの重りを事前に濡らして表面張力を壊し、それを平らなマウンドの上に置き、サンプルの重みがMCE紙の上に置かれるようにして、サンプルのドリフトを減らします。温めた aCSF をチャンバーに補充し、aCSF を毎分約 1 ミリリットルで循環させます。
25倍の水浸し対物レンズを備えたノーズピースをイメージングチャンバーに配置します。落射蛍光を使用して目的の標識細胞をスクリーニングし、イメージングボリュームを調整して目的の樹状突起の特徴をキャプチャします。
過飽和ピクセルと不飽和ピクセルの両方を識別するルックアップ テーブルを使用して、ピクセルが過飽和しないようにレーザー出力を調整します。3Dイメージングボリュームを取得し、希望のフレームレートで取得を繰り返します。イメージングボリュームは、サンプルのドリフトを補正するために、各時点間で調整できます。