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赤色蛍光タンパク質またはRFP発現をブロックするloxP側面のSTOPカセットを運ぶ遺伝子組み換えマウスの子犬を取ります。
子犬を特注の定位固定フレームに固定し、麻酔を維持するために氷で覆います。
頭皮を消毒し、ラムダを基準点としてマークします。
注射針をラムダを基準とした線条体座標に合わせ、頭蓋骨に穴を開
けます。針を頭蓋骨の表面に引っ込めてから、目標の深さに挿入します。
色素混合ウイルスベクターを制御された速度で線条体に注入します。このベクターは、緑色蛍光タンパク質またはGFPとCreリコンビナーゼをコードします。
溶液の逆流を防ぐために、針をゆっくりと引き抜きます。
子犬を取り除き、回復を待ちます。
線条体細胞では、ウイルスはゲノムを放出し、Cre リコンビナーゼと GFP の発現を可能にします。Creは、loxP側面のSTOPカセットを切除し、RFP発現を活性化します。
GFPとRFPの同時発現により、遺伝子操作の成功が確認されます。
手袋をはめた子犬をヘッドトレイに置き、ラテックススリーブの周りに砕いた氷を置き、低体温麻酔を維持します。次に、子犬の頭を70%エタノールでこすり、ラムダのランドマークを見つけます。マーカーでマークします。次に、針の先端をラムダに向け、前方、後方、および内側の横方向座標をゼロに設定します。
次に、脳アトラスを参照して、注射アームを標的部位に移動します。たとえば、P2子犬の線条体は、ラムダの前方2.4ミリメートル、正中線の両側に1.0ミリメートル、腹側1.7ミリメートルです。次に、ペンを使用してPE10チューブに高速緑色染料の位置をマークします。次に、針の先端が頭蓋骨の表面に接触するまで、皮膚と頭蓋骨を通してゆっくりと針を貫通し始めます。
背側腹側座標をゼロに設定します。次に、針をターゲット部位までゆっくりと下げます。所定の位置に着いたら、実質が通常の形状に戻るまで1分間待ちます。次に、マイクロインジェクションプログラムを毎分100ナノリットルで実行します。注入中、PEチューブ内で高速の緑色染料が移動するのを観察します。
針先が頭蓋骨の表面に接触するまで、皮膚と頭蓋骨に針をゆっくりと貫通することが重要です。注入中は、ファスト グリーン染料が PE チューブ内で移動するのを観察することが不可欠です。
注射が完了したら、1分間待ってから、針を貫通したDV深さの半分までゆっくりと持ち上げます。次に、さらに30秒待ってから、子犬の頭から針をゆっくりと引き抜きます。
注射が完了したら、1分間待ってから針をゆっくりと浸透したDVの深さの半分まで上げてから、さらに30秒待ってから子犬の頭からゆっくりと針を引き抜くことが重要です。
すべての標的部位を注入した後、摂氏33度のインキュベーターで子犬を20分間温めます。
子犬が胸骨の横臥位を取り戻すまで、5分ごとに子犬をチェックします。その後、子犬をダムに戻します。