マウス脳における標的ニューロン遺伝子編集のための定位固定性ウイルス注射

麻酔をかけたマウスを定位固定フレームに固定します。

剃った頭皮を消毒し、正中線を切開して頭蓋骨を露出させます。

頭蓋骨を乾燥させ、過酸化水素を塗布してブレグマの視認性を高めます。

ブレグマとラムダを特定し、ターゲットサイトを特定します。

ターゲット部位の頭蓋骨を慎重にドリルで開けます。

ウイルスで満たされた注射器を定位固定装置に取り付けます。

このウイルスは、歯状回ニューロンのゲノム編集のためのCas9とシングルガイドRNAをコードし、感染したニューロンを標識する蛍光レポーター

とともにコードします。

注射器を下げて歯状回に到達し、ウイルスをゆっくりと注入して均一な分布を確保します。

シリンジを徐々に上げ、追加の座標で注射を繰り返します。

逆流を防ぐために少し一時停止してから、針をゆっくりと引き抜きます。

反対側の

半球で手順を繰り返します。

最後に、切開部を縫合します。

この

モデルは、さらなる研究の準備が整いました。

注射部位の準備のために麻酔をかけたマウスの頭を剃ります。4%イソフルランをノーズコーンに直接注入します。次に、マウスを定位固定装置に置きます。イヤーバーを固定する前に、歯がスロットに落ちるまでバイトバーを口に挿入します。

動物の体が加熱パッドの上にあり、鼻がノーズコーンにあることを確認してください。次に、足をつまんで麻酔を確認します。次に、人工涙液を塗布して目を滑らかにします。その後、坊主頭をポビドンヨードとリドカインで拭きます。

次に、頭皮の正中線に沿って小さな切開を行います。綿棒で頭蓋骨を乾かし、過酸化水素を塗布してブレグマを視覚化します。解剖スコープを使用して、頭蓋骨のブレグマを見つけ、その上にドリルビットを置きます。x、y、z平面のデジタル定位座標を0に設定します。

ヘッドが吻側尾側のy軸で水平になるようにするには、ドリルビットをラムダに置き、z座標がブレグマとラムダでほぼ0に等しくなるようにヘッドを水平にします。ヘッドが x 軸に沿って水平になるようにするには、ドリル ビットをブレグマとラムダの中間点に置き、両側の中点から 1 ミリメートルの z 座標を測定して、それらが等しいことを確認します。

次に、イソフルランを2%に下げてから、ドリルを目的の座標の上に置き、頭蓋骨に慎重に穴を開けます。すべての穴を開けた後、ウイルスで満たされた注射器を定位固定装置に取り付けます。シリンジを穴の中央に置き、頭蓋骨のZ座標を0に設定します。シリンジを最も深いz深さまでゆっくりと下げ、定位固定インジェクターを使用して毎分0.25マイクロリットルの速度で注射を開始します。

最も深いZ深度で注入が完了したら、1分間待ってから次の座標まで上げてから、注入を再開します。すべてのZ注入座標が注入されるまで、このパターンを続けます。最後の注射後、2分間待ってからシリンジを取り外します。次に、定位固定装置からマウスを取り外し、頭皮を縫合します。リドカインと抗菌クリームを手術部位に塗布し、鎮痛剤を投与してから、動物を加熱された回復室に移します。