ニワトリ胚における神経および血管ネットワークの可視化

まず、

1〜7の体節レベルで神経管が切除された初期段階の胚を含む窓のある受精鶏卵から始めます。

ステージが一致したトランスジェニックニワトリ胚からGFP標識ドナー神経管を採取し、レシピエントに移植し、適切な解剖学的方向を確保します。

移植片の周囲の余分な液体を取り除き、ドナー組織と宿主組織の間の接着を強化します。

脱水や汚染を防ぐために、窓を透明なテープで密閉します。

胚が所望の段階に発達するまで卵子を孵化させます。

テープを剥がします。

胚に向かって血液を運ぶ卵黄の卵黄静脈を特定し、その上にある卵黄膜を取り除きます。

ガラス針を使用して、親油性蛍光色素を静脈に着実に注入します。

実体蛍光顕微鏡で胚を視覚化します。

注入された色素は血管の内側を覆う内皮細胞に結合して血管ネットワークを強調し、GFP 標識ニューラルチューブはニューラルネットワークの追跡を可能にします。

移植手順を開始する準備ができたら、解剖された神経管を時計ガラスから宿主胚に慎重に移します。ニューラルチューブを正しい向きに配置します。そして、隣接するエクスプラントを切除領域にそっと押し込みます。必要に応じて、マイクロメスを使用して、切除領域の正確なサイズに外植片をトリミングします。

正しい位置になったら、PBSやその他の液体を取り除き、ドナー組織と宿主組織が接着して移植片を確立するのを助けます。移植されたGFP陽性神経管の野生型ニワトリ宿主への統合の成功は、蛍光顕微鏡で評価できます。脱水や汚染を防ぐために、窓全体を幅 24 mm の透明テープで密閉します。

キメラ胚にラベルを付けます。そして、さらなる発育のために卵をインキュベーターに戻します。

目的の実験時点で、インキュベーターから卵を取り出します。そして、胚にアクセスするために透明なテープを剥がします。見えたら、卵黄のアクセス可能な静脈を見つけ、血流が胚に向けられていることを確認します。

注入位置の卵黄静脈の1つの分岐点を選択します。ピンセットを使用して、選択した注入点より上の卵黄膜を反対方向に引き裂いて除去します。次に、引っ張ったガラス針の直径を静脈のサイズに合わせて調整します。

針に5〜10マイクロリットルのDiI溶液をロードします。針を静脈に素早く挿入します。そして、口のチューブで着実に息を吹きかけ、DiIが血栓を形成せずにゆっくりと血流に加わるようにします。DiI注入の成功は、蛍光顕微鏡で胚を簡単に観察することで評価できます。