マウス皮質ニューロンにおける軸索分岐のリアルタイム in vitro イメージング

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マウス胚皮

質ニューロンを含むガラス底イメージング皿を取ります。

ディ

ッシュを示差干渉コントラスト(DIC)顕微鏡の環境チャンバー内に置き、イメージング中の細胞生存率を維持します。

DIC顕微鏡は、偏光を2つのビームに分割し、試料を横切ります。

試験片全体の屈折率の変化により、これらのビーム間に位相シフトが生じます。

ビームが再結合すると、その干渉により高コントラストの画像が生成され、より微細な細胞構造が見えるようになります。

索が分岐していないニューロンを同定し、タイムラプスイメージングを使用して軸索の分岐を視覚化します。

索受容体に結合し、局所的なエキソサイトーシスを引き起こす細胞外誘導手がかりであるネトリン-1で治療します。

エキソサイトーシス小胞は膜成分を部位に送達し、細胞骨格は膜拡張をサポートするために再編成されます。

顕微鏡下では、これらの変化は小さな突起として現れ、軸索分岐の始まりを示します。

時間が経つにつれて、これらの突起は成熟した軸索枝に発達し、ニューロンの発達の動的なプロセスを示しています。

in

vitroで2日間、トランスフェクションされていないニューロンを含むガラス底イメージング皿を予熱した湿った環境チャンバーに入れます。60倍平面アポクロマート、1.4 NA、DIC対物レンズ、高開口数コンデンサーを搭載した顕微鏡を使用して、最高の画質と解像度を実現します。次に、透過光照明を使用して焦点面を調整して、眼鏡を通してニューロンを見つけます。

軸索分岐のDICイメージングでは、画像の最適化にはクール照明の適切なセットアップが不可欠であり、分析可能な結果を生成するために重要です。次に、視野内に関心のあるニューロンを使用して、イメージングソフトウェアのマルチエリア取得機能を使用して、少なくとも6つの細胞のXYZ位置を見つけて保存します。次に、細胞を刺激するためにネトリン-1またはその他の関心因子を1ミリリットルあたり250ナノグラムの最終濃度に追加し、マルチエリア取得の開始を押します。

24時間、20秒ごとに各位置の画像を順次取得し、必要に応じて取得を一時停止し、焦点を合わせ直します。イメージングソフトウェア内で、[アプリ]、[多次元データの確認]を選択して画像を確認し、目的のファイルを開きます。イメージングセッション中に形成される安定した軸索枝を特定します。トレース領域ツールを使用して、軸索の基部から先端までの安定した軸索分岐を測定します。

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最終更新:1 8月 2026