マウス海馬におけるミクログリアダイナミクスのin vivo二光子イメージング

ミクログリアで蛍光タンパク質を発現する麻酔トランスジェニックマウスを取ります。電動ステージを備えた定位固定フレームに、2光子顕微鏡下で固定します。

頭蓋骨には、海馬角アンモニス 1 または CA1 領域の上の肺胞を穏やかに平らにするガラス底の金属チューブが取り付けられており、

下にある組織に過度の圧力

をかけることなく、明確な光学界面を確保します。

金属管に水を入れて、光伝送を最適化します。

励起波長でパルスレーザーを作動させます。

脳実質からの蛍光と金属管からの反射光を使用して、CA1領域の焦点を調整します。

マウスのヘッドの位置を変更して、ガラス底をイメージング平面と平行に位置合わせし、視野全体に均一な焦点を確保します。

最適な分解能が得られるように対物レンズを調整し、CA1領域のin vivoミクログリアダイナミクスを観察します。

次に、歯状回を画像化し、蛍光ミクログリアがCA1の完全性を確認します。

マウスを、2光子顕微鏡の対物レンズの下と電動XYスキャンステージのヘッド保持装置にセットします。次に、気泡を発生させずに、ガラス底と対物レンズの間のスペースを水で満たします。パルスレーザーによる連続照明下で、脳実質から発せられる蛍光と金属管の端からの反射光の誘導を受けながら、焦点をCA1に調整します。

ガラスの底がイメージ面と平行になるようにヘッド保持装置を傾けてマウスヘッドの角度を調整します。次に、対物レンズの補正カラーを調整して、CA1のターゲット構造の深さで最高の解像度を実現します。次に、ガラス底から500マイクロメートルの深さにある歯状回の分子層(DG)の蛍光細胞が全視野で画像化されることを確認します。手術が成功した場合にのみ、DG信号をすぐに検出できます。

ミクログリアが分岐した形態を回復したことを確認します。次に、CA1の目的の層でin vivoイメージングを実行します。