共焦点顕微鏡を使用したマウス神経終末の高速カルシウム過渡現象のイメージング

共焦点顕微鏡下に配置された固定されたマウスの筋肉を含むシリコーンエラストマーコーティングされた実験室から始めます。

筋肉は、筋肉の収縮をブロックする阻害剤を含む生理学的溶液に浸されます。

蛍光カルシウム色素で標識された神経断端は、電気刺激装置に接続された吸引電極の内側に配置されます。

神経筋接合部では、末梢神経が筋肉に接続されています。

電極を使用して神経に電気刺激を加えます。これにより、細胞内カルシウム色素に結合するカルシウムイオンの急速な流入が引き起こされます。

神経筋接合部を照らしてカルシウム色素を興奮させ、蛍光を発します。

次に、高解像度の画像をキャプチャして、末梢神経終末の急速なカルシウム過渡現象を記録します。

関心領域を選択し、蛍光強度を測定します。

蛍光強度の急激な増加は末梢神経終末でのカルシウム流入を示し、減少はカルシウムクリアランスを反映しています。

灌流システムに10マイクロモルのD-ツボクラリンを含むリンゲル液を充填し、灌流吸引ポンプのスイッチを入れて灌流を開始します。レーザー走査型共焦点顕微鏡(LSCM)ソフトウェアで、電気生理学と取得モードを選択してイメージングパラメータを設定します。ジョブメニュー設定で、顕微鏡同期パルスで刺激装置をトリガーするトリガー設定を選択し、フレームフィールドでトリガーアウトをOUT 1チャンネルに設定します。

スキャンモードを1,400ヘルツのスキャン周波数でxytにします。ズーム係数は、ピンホールが完全に開いた状態で 6.1 にする必要があります。シーケンシャル・トランスパス双方向 x モードがオンになっていることを確認します。次に、フレームを形成する最小時間を 52 ミリ秒に設定し、生ビデオのフレームを 20 フレームで収集します。アルゴンレーザーの励起波長を488ナノメートルに設定し、出力電力の8%に設定します。

パラメータを設定したら、ライブモードボタンを押すと、色素がロードされた神経終末のライブプレビューが表示されます。ライブモードでは、関心領域(ROI)を検索して最適な焦点を取得し、刺激装置の遅延を前の値と比較して2ミリ秒少なくシフトします。そして、データ収集ソフトウェアを実行して、各シーケンスを前のシーケンスから2ミリ秒シフトして26のシーケンス