精巣カプセル内奇形腫の発生
2011年11月7日
ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は、様々な疾患の無数を治療する可能性があります。これらの細胞のユーティリティは、身体内の任意の細胞型に分化することができるという事実にある。ここではhPSCsのpluripotenceを実証するために使用される奇形腫アッセイを、説明します。
この手順の全体的な目的は、ヒト多能性幹細胞（H PSCs）を用いて免疫不全マウスの精巣被膜内にテラトーマを形成させ、多能性を評価することです。まず、多能性試験を行う予定のH PSCs候補の培養物を回収します。次に、手術を行ってマウスの精巣を露出させ、細胞を精巣被膜内に注入します。
精巣を元の位置に戻し、外科的にマウスを閉鎖します。6～12週間後、得られた腫瘍を組織学的に検査し、各胚葉由来の細胞が存在することを確認します。最終的に、免疫不全マウスにおいて3つの胚葉すべての細胞に分化できることを示すことで、HPSCラインが真に多能性であることを実証できます。ヒト幹細胞の多能性を実証するための新しい手法が近年報告されていますが、テラトーマアッセイはこの分野におけるゴールドスタンダードであり、本手順は私の研究室のシニアテクニシャンであるtron、Cultureによって実演されます。
ヒト多能性幹細胞を共培養し、その後Accutaseを用いてhPSCを分散させます。細胞数を計数し、1回の注入あたり100万個のhPSCを再懸濁します。まず、麻酔をかけた免疫不全マウス系統の6週齢雄マウスの腹部をバリカンで剃毛します。ポビドンヨード溶液を用いて、腹部の中央から時計回りに外側に向かって、マウス腹部の前壁を洗浄します。
次に、除毛した部位を70% ethanolで洗浄します。スワブを毎回交換しながら、この工程を3回繰り返します。手術を行うために、滅菌済みの手術用ハサミを用意し、動物を滅菌フード内のヒーティングパッドに移します。
ピンセットで腹膜を保持しながら、股関節の直下のレベルで皮膚と腹膜に1 cmの縦切開を加えます。別の滅菌ピンセットを右股関節方向へ差し込み、白く脂肪状の組織を付随する精巣とともに牽引します。次に、1 CCのツベルクリン用注射器に注射するhpscを満たします。主要な血管を避け、精巣被膜の中央に20から30 µLのH PSCsをゆっくりと注入します。
細胞の逆流を防ぐため、ピンセットを用いて針をゆっくりと抜きます。精巣と脂肪組織を腹腔内の元の位置に戻します。腹膜を2〜3本の吸収性縫合糸で縫合し、皮膚をオートクリップで閉じます。
術後、必要に応じて1日2回鎮痛剤を投与します。6～12週間にわたり、腫瘍の触知可能な増殖を観察します。腫瘍サイズがおよそ5 mmに達した時点で、安楽死させたマウスから腫瘍を摘出し、記録します。
腫瘍を撮影し、サイズと重量の両方を測定します。その後、腫瘍を小さく切断し、組織病理学的検査のために4%パラアルデヒド溶液で固定します。通常、6〜12週間後にテラトーマが観察されます。
この例では、100万個のヒトWA09多能性幹細胞を免疫不全マウスの精巣被膜に注入しました。テラトーマを詳細に観察すると、不均一性と多くの付着嚢胞が認められます。これは予想通りの結果です。
組織病理学的解析により、3つの胚葉それぞれの細胞の存在が示されます。この手順を行う際は、アッセイが正しく実施されたかを確認するため、十分な分化能を持つことが分かっている陽性対照細胞株を必ず含めるようにしてください。このビデオを視聴することで、ヒト幹細胞株が多能性であるかどうかを判定する方法について十分に理解できるはずです。
概要
本記事では、ヒト多能性幹細胞（hPSCs）の多能性を評価するために用いられる手法であるテラトーマアッセイ（ тераトーマ形成試験）について解説します。このアッセイでは、免疫不全マウスの精巣被膜内にhPSCsを注入し、形成されたテラトーマがさまざまな細胞型に分化しているかを確認します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 幹細胞生物学
- 再生医療
- 組織病理学
背景
- ヒト多能性幹細胞は、あらゆる細胞型に分化することが可能です。
- テラトーマ（奇形腫）形成は、多能性の重要な指標となります。
- このアッセイは、多能性を証明するためのゴールドスタンダードであると考えられています。
- 新しい手法も存在しますが、テラトーマアッセイは引き続き広く用いられています。
研究の目的
- テラトーマ形成を通じてhPSCの多能性を実証すること。
- テラトーマアッセイを実施するための詳細な手法を提供すること。
- アッセイにおいてポジティブコントロールを使用することの重要性を強調すること。
使用した手法
- hPSCの回収および注入準備。
- マウス精巣の外科的露出およびhPSCの注入。
- 6週から12週にわたる腫瘍増殖のモニタリング。
- 胚層分化を確認するためのテラトーマの組織学的解析。
主な結果
- 注入後6～12週間でテラトーマが形成された。
- 組織病理学的解析により、3つの胚葉すべての細胞の存在が確認された。
- 多能性を評価する上でのテラトーマアッセイの有効性が実証された。
- アッセイ結果を検証するために、ポジティブコントロールを含めた。
結論
- テラトーマアッセイは、hPSCsの多能性を確認するための信頼性の高い手法である。
- 良好な結果を得るためには、適切な外科的手技とモニタリングが不可欠である。
- 今後の研究では、従来のアッセイに加えて代替法の検討が行われる可能性がある。
よくある質問
産業界における重要性
テラトーマアッセイは、生体内で3つの胚葉すべてへの分化能を実証することにより、多能性の機能的な判定指標を提供します。このアッセイは、初期の幹細胞ベースの治療法開発におけるターゲットの検証およびメカニズムのリスク低減を支援します。これにより、前臨床モデルに進む前に、細胞の同一性について予測的な信頼性を得ることが可能になります。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期段階の発見および標的バリデーション
- 科学的価値：外胚葉、中胚葉、および内胚葉への分化を確認することで、多能性を立証する。
- 運用的価値：標準化されたin vivoモデルを用いることで、多能性に関する偽陽性の主張を減少させる。
- 戦略的価値：治療開発における幹細胞株の適合性について、継続または中止（go/no-go）の判断を可能にする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：胚葉表現に関する定量的組織病理学的出力を生成する。
- 運用の価値：免疫不全マウスへの精巣被膜内注射を用いた再現性のあるプロトコルを確立する。
- 戦略的価値：一貫した多能性試験に向けた、研究室間でのアッセイ標準化を支援する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：系統特異的な前駆細胞へ分化させる前に、hPSCsの発達能を検証する。
- 運用の価値：腫瘍形成のモニタリングおよび組織病理学的解析のため、6〜12週間の観察を必要とする。
- 戦略的価値：リスク調整に基づいた、前臨床有効性試験への幹細胞株の移行に役立つ。
パイプラインおよびワークフローの統合
テラトーマアッセイは、幹細胞発見の連続的なプロセスにおけるゲートキーピングステップとして機能し、多能性維持の後、および分化誘導または前臨床有効性試験の前段階に位置づけられます。
- 探索生物学： 三胚葉分化能を評価することで、多能性の核心的な仮説を検証する。
- スクリーニング： 標準化されたテラトーマ形成率および組織学的スコアリングを提示し、細胞株間の比較評価を可能にする。
- 分析： 病理組織学的検査を通じて胚葉特異的なリードアウトを提供し、分化能を定量化する。
- トランスレーショナルリサーチ： 多能性の確認から、疾患関連細胞の作製に向けた下流の分化ワークフローへの橋渡しを行う。
- 企業の再利用： 治療パイプラインのスクリーニングにおける、複数のhPSC株に対する再利用可能な多能性チェックポイントとして機能する。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 機能的な多能性を確認することで、幹細胞のアイデンティティにおける機序的な曖昧さを低減します。
- 運用上の価値： 定義された外科的および組織学的処置を通じて、標準化され再現性のある結果を提供します。
- 戦略的価値： 開発の早期段階で非多能性ラインを排除することにより、資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： 分化および疾患モデリングへの投資に向けた、リスクベースの幹細胞ラインの優先順位付けを可能にします。
実施上の考慮事項
- 精巣被膜内注射のための、げっ歯類の手術および無菌操作に関する専門知識が必要です。
- 免疫不全マウス系統へのアクセスおよび術後のモニタリング施設の利用が前提となります。
- テラトーマ切片における胚層の同定のため、組織病理学的検査のインフラ設備が必要です。
- 腫瘍形成性試験における動物の使用について、倫理委員会の監督およびIACUCの承認が必要です。
- 6～12週というタイムラインによる制限があり、反復的なスクリーニングキャンペーンの速度が低下する可能性があります。
