組換えミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の単離と精製

0 閲覧数3:59 • August 7th, 2025

MOGtagは、実験的自己免疫性脳脊髄炎研究のための可溶化および精製タグと融合した組換えミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質です。

MOGtagを単離するには、MOGtagを発現する細菌細胞を溶解バッファーに懸濁し、インキュベートします。

緩衝液中の酵素と界面活性剤は、膜脂質を破壊し、細胞壁を劣化させます。

超音波処理して細胞をさらに溶解し、MOGtagを含む不溶性封入体を放出します。

封入体をペレット化するための遠心分離機。上清を廃棄し、ペレットをバッファーに再懸濁し、インキュベートします。

酸グアニジンを加え、インキュベートしてMOGtagを可溶化します。

溶性タンパク質を荷電したニッケル樹脂に移し、混合し、振とうしながらインキュベートして、MOGtagがニッケルイオンに結合できるようにします。

結合したMOGtagをペレット化するための遠心分離機。上清を除去し、ペレットを溶出バッファーに再懸濁し、振とうしながらインキュベートします。

溶出バッファー中のイミダゾールは、樹脂からMOGtagを放出します。

再度遠心分離し、精製したMOGtag含有上清を回収し、さらなる分析のために保存します。

高速遠心分離に対応した250ミリリットルのボトルに培養物を均等に分散させ、この時点からボトルを氷上に置いておく。細菌細胞を摂氏4度で15分間22,000 * gでペレット化します。すべての細菌ペレットを再停留させ、合計30ミリリットルの溶解バッファーに結合します。この容量を、高速遠心分離が可能な丸底の50ミリリットルチューブに移します。

このチューブを摂氏30度の水浴に30分間入れます。インキュベーション期間中、チューブを2回振って細胞を再懸濁します。インキュベーション後、チューブを氷上に移し、溶液を20キロヘルツ、振幅70%で超音波処理し、5パルスで3秒間オン、3秒間オフします。5パルスの合計6ラウンドにわたって溶液を超音波処理し、ラウンドの合間に溶液を氷上で冷却します。

次に、溶液を摂氏4度で24,000 * gで15分間遠心分離し、次にペレットを30ミリリットルのバッファーAに再懸濁し、溶液を摂氏4度で3時間インキュベートします。次に、17.2グラムのグアニジン-HClを溶液に加えます。サンプルを氷上で1時間インキュベートして、MOGタグタンパク質を可溶化します。MOGタグタンパク質を精製するには、可溶化タンパク質の全量をニッケル樹脂を含む最初のチューブに移します。混合後、チューブを摂氏4度のロッカーに水平に1時間置きます。

チューブを4,500 * gで摂氏4度で8分間遠心分離した後、上清をニッケル樹脂の2番目のチューブに移し、以前と同様にインキュベートします。その間に、最初のチューブのニッケル樹脂を40ミリリットルの溶出バッファーに再存在させ、チューブを摂氏4度のロッカーに水平に5分間置いてから、以前と同様に遠心分離します。溶出したMOGタグタンパク質を含む上清を、標識された精製MOGタグタンパク質を標識した250ミリリットルのボトルに移します。このボトルは摂氏4度に保ちます。

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最終更新:29 8月 2026