中枢神経系疾患を治療するためのマウスモデルにおけるウイルスのくも膜下腔内送達

アデノ随伴ウイルス(AAV)と局所麻酔薬であるリドカインを含む溶液を注射器に充填します。

起きているマウスをうつ伏せの姿勢に置き、上半身を覆います。

マウスの骨盤帯を持ち、腰を剃って皮膚を露出させます。ヨウ素とエタノールで滅菌します。

背骨下部の隙間を見つけ、軽く押して印を付けます。

テールを回転させて背骨を揃え、シリンジを垂直に挿入します。

テールフリックが発生するまで角度を調整し、脳脊髄液またはCSFが流れるくも膜下腔内腔への針の侵入を確認します。

均一に分布するために溶液をゆっくりと注入します。

ウイルス粒子はニューロンに結合し、内部に入り、その遺伝物質を核に放出し、標的遺伝子発現を可能にします。

リドカインは神経信号を一時的に遮断し、短期間の脚の麻痺を引き起こし、CSF への送達の成功を確認します。

このプロトコルは、髄腔内送達を中枢神経系疾患を治療するための効果的な方法として確立します。

手順を開始する前に、27ゲージの針を25マイクロリットルのハミルトンシリンジに取り付け、針の面取りされた先端をシリンジの体積スケールに合わせ、次に8マイクロリットルの4×10から10のゲノムコピーを慎重にロードしますウイルス溶液の気泡を避けるように注意して。

次に、生後30〜70日、12〜30グラムの目覚めたマウスを、バイオセーフティフードのうつ伏せのベッドピースの上に置き、上半身を滅菌ガーゼで覆ってマウスを落ち着かせ、噛まれないようにします。マウスを骨盤帯でしっかりと握り、片側に親指、反対側に人差し指と中指を置き、親指と人差し指で両側骨盤帯の間の皮膚をぴんと張った状態に保ち、次に両側骨盤帯の間の毛皮を剃り、露出した皮膚をヨウ化物ベースのスクラブと70%エタノールで滅菌します。

アデノ随伴ウイルス溶液の直接髄腔内送達のために、両側骨盤帯の間の正中線に沿って椎間腔を触診し、爪を使用して皮膚へのくぼみを押し下げて、L5からL6椎間腔を示します。尻尾の付け根をわずかにゆっくりと回転させて背骨の正中線を明らかにし、針の斜角を動物の頭に向かって調整します。マウスを所定の位置にしっかりと固定した状態で、脊椎の正中線に沿って針を揃え、注射器を中央矢状面に保ちながら、針をくぼみの中心に静かかつ垂直に挿入します。

針が骨に接触したら、ゆっくりと角度を約30度まで減らし、針を椎間腔に滑り込ませます。突然のテールフリックは、硬膜内腔への侵入が成功した兆候です。針が椎間腔に入ると、先端がしっかりと固定されているように感じます。ベクター溶液を注入し、針を硬膜内腔内に1分間維持し、漏れを最小限に抑えるために回転しながら針をゆっくりと引き抜きます。