Name: 嗅神経細胞の繊毛のケージド化合物のフラッシュフォトリシス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: 学ぶケージド化合物のフラッシュフォトリシスを用いたマウス嗅神経細胞のパッチクランプ記録法。この手法によりcAMPやCaの局所放出とイオン電流測定が可能となり、嗅覚信号伝達機構の理解が深まります。

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<ol><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+compounds%3A+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).</li>
<li>Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+nucleotide-gated+ion+channels+in+sensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction.</a> FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).</li>
<li>Bozza, T. C., Kauer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+response+properties+of+convergent+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons.</a> J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).</li>
<li>Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+and+Ultrafast+Phototriggers+for+cAMP+and+cGMP+by+Using+Long-Wavelength+UV%2FVis-Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).</li>
<li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).</li>
<li>Rapp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+lamp-based+irradiation+of+caged+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Flash lamp-based irradiation of caged compounds.</a> Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).</li>
<li>Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGurney%2C+AM+%22Microelectrodes%3A+Theory+and+Applications%22">Microelectrodes: Theory and Applications</a>. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).</li>
<li>Lagostena, L., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+and+photolysis+of+caged+compounds+in+olfactory+sensory+neurons+isolated+from+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse.</a> Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).</li>
<li>Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+adaptation+in+mouse+olfactory+sensory+neurons+does+not+require+the+activity+of+phosphodiesterase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase.</a> J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).</li>
<li>Boccaccio, A., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+development+of+cyclic+nucleotide-gated+and+Ca2%2B+-activated+Cl-+currents+in+isolated+mouse+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).</li>
<li>Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+concentration+jumps+reveal+dynamic+ion+selectivity+of+calcium-activated+chloride+currents+in+mouse+olfactory+sensory+neurons+and+TMEM16B-transfected+HEK+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells.</a> J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).</li>
<li>Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+Functional+Analysis+of+Ion+Channels+Heterologously+Expressed+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).</li>
<li>Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Responses+of+Mouse+Olfactory+Sensory+Neurons+Using+the+Air-phase+Electroolfactogram+Recording%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording.</a> J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).</li>
<li>Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+photolysis+using+a+light+emitting+diode%3A+an+efficient%2C+compact%2C+and+affordable+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Calcium%22%5BJournal%5D)">Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution.</a> Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

パッチクランプ記録と組み合わせケージド化合物のフラッシュの光分解は、生理活性分子の濃度の内側と外側の細胞の両方の急激かつ局所ジャンプを取得するために便利なテクニックです。ケージcompounds1のいくつかの種類が合成され、そしてこの技術は、アクティブまたは利用可能なケージド化合物11のいくつかの光分解によって変調することができるイオンチャネルを発現する培養細胞など、様々なタイプに適用することができます。 ケージド化合物の光分解は短時間での分子の十分な量を刑務所から出すために近紫外光の高強度のパルスを必要とします。連続運転水銀やキセノンアークランプシャッターで制御し、顕微鏡の落射蛍光ポート、キセノンフラッシュランプ、UVレーザに結合し、そして最近開発された高出力の紫外線発光ダイオード（LED：様々な光源を使用することができます。 ）。光源の種類によって、それぞれ長所と短所を持っています特定のアプリケーションに、装置のコストに応じて利点とし。フラッシュランプと比較して、連続的に作動ランプが低い光強度を持っているため、シャッターで制御される光パルスの持続時間はun...

<table border="1"><tbody><tr><th>機器の</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>顕微鏡にアダプターモジュールフラッシュランプ</td><td>ラップオプトエレクトロニクス</td><td>フラッシュキューブ70 </td><td></td></tr><tr><td>空気テーブル</td><td> TMC </td><td> MICRO - G 63から534 </td><td></td></tr><tr><td>デジタイザー</td><td>軸索インスツルメンツ</td><td> Digidata 1322A </td><td></td></tr><tr><td>データ収集ソフトウェア</td><td>軸索インスツルメンツ</td><td> pClamp 8 </td><td></td></tr><tr><td>データ解析ソフトウェア</td><td> WaveMetrics社</td><td>イゴール</td><td></td></tr><tr><td>アダプタモジュールのためのミラー</td><td>ラップオプトエレクトロニクス</td><td> M70/100 </td><td></td></tr><tr><td>電極ホルダー</td><td>軸索インスツルメンツ</td><td> 1 - HL - U </td><td></td></tr><tr><td>ファラデーのかご</td><td>カスタムは行わ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィルターキューブ</td><td>オリンポス</td><td> U - MWU </td><td>励起フィルターは削除</td></tr><tr><td>フラッシュランプ</td><td>ラップオプトエレクトロニクス</td><td> JML - C2 </td><td></td></tr><tr><td>鉗子デュモン＃55 </td><td>世界の精密機器</td><td> 14099 </td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー</td><td>世界の精密機器</td><td> PG10165 - 4 </td><td></td></tr><tr><td>ガラスボトムディッシュ</td><td>世界の精密機器</td><td> FD35 - 100 </td><td></td></tr><tr><td>照明器</td><td>オリンポス</td><td>ハイライト3100 </td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> IX70 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレータ</td><td> Luigs＆ノイマン</td><td> SM I </td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプラー</td><td>ナリシゲ</td><td> PP - 830 </td><td></td></tr><tr><td>モニタ</td><td> HesaVision </td><td> MTB - 01 </td><td></td></tr><tr><td> NDフィルター</td><td>オメガオプティカル</td><td>変化</td><td></td></tr><tr><td>客観100X </td><td>ツァイス</td><td> Fluar 440285 </td><td>ツァイスやOlympuのどちらかの</td></tr><tr><td>客観100X </td><td>オリンポス</td><td> UPLFLN 100XOI2 </td><td>ツァイスやオリンパスのどちらか</td></tr><tr><td>光学UVショートパスフィルター</td><td>ラップオプトエレクトロニクス</td><td> SP400 </td><td></td></tr><tr><td>パッチクランプアンプ</td><td>軸索インスツルメンツ</td><td> Axopatch 200B </td><td></td></tr><tr><td>フォトダイオードの組立</td><td>ラップオプトエレクトロニクス</td><td> PDA </td><td></td></tr><tr><td>石英ライトガイド</td><td>ラップオプトエレクトロニクス</td><td>変化</td><td>我々は、600μmの直径を使用してください</td></tr><tr><td>銀線</td><td>世界の精密機器</td><td> AGT1025 </td><td></td></tr><tr><td>シルバーグランドペレット</td><td>ワーナーの楽器</td><td> 64から1309 </td><td></td></tr><tr><td>キセノン​​アーク燈</td><td>ラップオプトエレクトロニクス</td><td> XBL - JML </td><td></td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><th>試薬</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> BCMCM -ケージドcAMPの</td><td> BioLog </td><td> B016 </td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA） </td><td>シグマ</td><td> A8806 </td></tr><tr><td>塩化カルシウム標準液0.1 M </td><td>フルカ</td><td> 21059 </td></tr><tr><td>ケージのCa：DMNP - EDTA </td><td>インビトロジェン</td><td> D6814 </td></tr><tr><td>システイン</td><td>シグマ</td><td> C9768 </td></tr><tr><td>コンカナバリンタイプV（ConA） </td><td>シグマ</td><td> C7275 </td></tr><tr><td>塩化セシウム</td><td>シグマ</td><td> C4036 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td>シグマ</td><td> D8418 </td></tr><tr><td> DNアーゼI </td><td>シグマ</td><td> D4527 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td>シグマ</td><td> E9884 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td>シグマ</td><td> E4378 </td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ</td><td> G5767 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマ</td><td> H3375 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>シグマ</td><td> P3911 </td></tr><tr><td> KOH </td><td>シグマ</td><td> P1767 </td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>シグマ</td><td> L0649 </td></tr><tr><td> MgCl2を</td><td>フルカ</td><td> 63020 </td></tr><tr><td>パパイン</td><td>シグマ</td><td> P3125 </td></tr><tr><td>ポリ- L -リジン</td><td>シグマ</td><td> P1274 </td></tr><tr><td> NaClを</td><td>シグマ</td><td> S9888 </td></tr><tr><td> NaOHで</td><td>シグマ</td><td> S5881 </td></tr><tr><td> NaPyruvate </td><td>シグマ</td><td> P2256 </td></tr></tbody></table>

嗅神経細胞の繊毛のケージド化合物のフラッシュフォトリシス

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

ケージド化合物の光分解は、様々な生理活性化合物1の濃度の急激かつローカライズされた増加の生産を可能にする。ケージド化合物は紫外光のフラッシュと壊れる可能性の化学ケージで生理的に非アクティブに分子である。ここでは、解離マウス嗅神経細胞における嗅覚情報伝達の研究のためのケージド化合物の光分解を組み合わせたパッチクランプ記録を取得する方法を示します。嗅覚情報伝達のプロセス（図1）の受容体に結合する嗅覚は、環状ヌクレオチド依存性（CNG）チャネル2を開くcAMPの増加につながる嗅神経細胞の繊毛で行われます。 CNGチャネルを通じて、CAエントリは、Ca活性化塩素チャネルを活性化する。我々は、マウス嗅上皮3、どのようにケージキャンプ4の光分解またはCa 5をケージでCNGチャネルまたはCa活性化塩素チャネルを活性化するから神経細胞を分離する方法を示しています&lt;/&gt;のSup。我々は、パッチクランプ記録をホールセル電圧クランプの設定8-11の電流を測定するために取られている間、おりから出すのcAMPやCaに毛様体部分に紫外線が点滅を適用するにはフラッシュランプ6,7を使用してください。

ケージド化合物の光分解は、様々な生理活性化合物の濃度の急激かつローカライズされた増加の生産を可能にする。ここでは、解離マウス嗅神経細胞における嗅覚情報伝達の研究のためのケージドcAMPまたはケージのCaの光分解を組み合わせたパッチクランプ記録を取得する方法を示します。

ケージ化合物（caged compounds）の光分解により、さまざまな生理活性物質の濃度を、迅速かつ局所的に上昇させることが可能になります1。

嗅覚によって、私たちは外部環境にある揮発性化学物質を検知し、識別することができます。これらの物質は嗅覚神経細胞の樹状突起にある受容体に結合し、変換カスケードを活性化させます。これにより、サイクリックヌクレオチドゲートチャネルが開口し、続いてカルシウム活性化クロライドチャネルが開口します。本手順の全体的な目的は、ケージ化合物を用いてこれらのチャネルを直接活性化する方法を示すことです。ケージ化合物とは、化学的なケージによって生理学的に不活性化された分子のことです。紫外線フラッシュを照射することでケージを破壊し、生理活性化合物ケージを放出させます。Cycl、mp、またはケージカルシウムを細胞内液に含ませ、パッチピペットを満たし、嗅覚感覚ニューロンの細胞質に拡散させます。パッチクランプ記録を行い、ホールセル電位クランプ構成で電流を測定しながら、細胞体領域に超高速フラッシュを照射して、cycling、MPまたはカルシウムを活性化させます。こんにちは。本日は、ケージ化合物のFEポリシーを組み合わせたパッチクランプ記録の手順をご紹介します。当研究室では、この手法を用いて、嗅覚センサーニューロンにおけるcMPゲートチャネルおよびカルシウム活性化コリンチャネルの研究を行っています。それでは、始めていきましょう。本研究で使用したパッチクランプ記録システムは、倒立顕微鏡、灌流システム、マイクロマニピュレーター、記録電極、およびパッチクランプアンプのヘッドステージに接続された参照電極で構成されており、これらすべてがファラデーケージ内の防振台上に設置されています。パッチクランプアンプは、データ収集ソフトウェアを搭載したコンピュータ内のデジタイザに接続されています。高強度の紫外線フラッシュを発生させるために、Excelonフラッシュランプを使用します。光フラッシュは、手動または電気生理学的データ収集を制御するのと同じソフトウェアを使用してコンピュータでトリガーできます。光実験に最適な波長は、出力スロットまたはフラッシュランプにUVフィルターを挿入することで選択します。光フラッシュの強度は、フラッシュランプの電圧または静電容量を変更することで調整可能です。フラッシュランプの2番目の出力スロットに中性密度フィルターを配置することで、光強度のより精密な制御が可能になります。フラッシュ光は、石英ファイバー光導波路を介して、ガラス底ディッシュ上にプレートしたニューロンに照射されます。この光導波路は、倒立顕微鏡のエピ蛍光アタッチメントに接続されています。アダプターを使用し、励起フィルターを除いた改造フィルターキューブによって、ダイクロイックミラーを介してUVビームをニューロンに導きます。光は100倍油浸対物レンズを通して集光させます。ライトガイドを照明装置に挿入することで、組織で覆われた領域を可視

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多光子顕微鏡は深く、光浸透と低光毒性を持つ低エネルギーの光子の制御が可能になります。我々は、ゼブラフィッシュ胚における生細胞標識のためのこの技術の使用について説明します。このプロトコルは、容易に様々な光反応性分子の光誘導に適合させることができる。...

ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化

方法は、蛍光イメージングのための別の脊椎動物種から単生きた光受容細胞の調製のために説明されています。方法は、画像にそのようなNADHやビタミンAなどの内因性蛍光体の蛍光を使用し、又はCaに敏感な外因的に添加蛍光色素のことができる...

蛍光イメージングのための生活絶縁脊椎動物視細胞の調製

我々は生きているの触角葉で匂い誘発カルシウム応答を測定し、分析するための確立された技術を記述する...

の臭気誘発応答のカルシウムイメージングショウジョウバエ触角葉

この記事では、マウスの嗅球の表面にマップ臭気誘発活動に固有の光信号とflavoproteins自家蛍光信号のイメージングのプロトコルを示す。...

光反射率と自家蛍光信号を用いたマウス嗅球におけるイメージングの臭い誘発活動

ChR2を表現成人生まれのニューロンは嗅覚神経回路の機能に向けての貢献を検討するために、スライスの電気生理学的な準備に操作することができます。...

ニューロンの光刺激のために手ごろな価格のLEDアレイを使用する

このビデオは、ハエのシナプス局在カルシウムセンサーを使用したin...

インビボDrosophila melanogasterにおけるシナプス局在カルシウムセンサを用いたカルシウムイメージング

その小さな透明体、定評の神経解剖学と従順な遺伝学的手法および試薬のホストと、...

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

私たちは、全細胞パッチクランプおよびマウス脳の急性組織切片における樹状突起および海馬ニューロンのスパインにおける細胞内ナトリウム過渡の多光子イメージングによる神経活性化合物の焦点UV誘導光活性化の組合せを記載。...

CA1錐体ニューロンにおけるグルタミン酸のUV媒介焦点アンケージングと組み合わせることで、多光子細胞内ナトリウムイメージング

私たちは、ミリ秒の時間分解能を有する膜ダイナミクスの可視化を可能にし、電子顕微鏡、「フラッシュおよび凍結、」における新規技術を開発しました。この技術は、高圧凍結とニューロンの光遺伝学的刺激を兼ね備えています。ここでは、手順を示し、詳細なプロトコルを記述します。...

フラッシュとフリーズ：電子顕微鏡でメンブレンダイナミクスをキャプチャするために新しい技術

シナプス小胞 (SV) 神経シナプスでの細胞間コミュニケーションの中核機構は、サイクリングします。FM 色素取り込みと放出は、定量的 SV 遠藤と分泌の試金の主な手段です。ここでは、我々 は FM1 43ショウジョウバエの神経筋接合部 (NMJ)...

シナプスでサイクリング FM 色素: 高カリウムの脱分極、電気とチャネルロドプシン刺激の比較

ここでは、ショウジョウバエの学習と記憶の文脈で、前および/または後のカルシウムを視覚化できるプロトコルを提示する。シナプス的に局在するカルシウムセンサを用いた生体内カルシウムイメージングでは、この種の連想学習の根底にあるシナプス可塑性が決定され得るように、古典的な嗅覚調節パラダイムと組み合わされる。...

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

学ぶケージド化合物のフラッシュフォトリシスを用いたマウス嗅神経細胞のパッチクランプ記録法。この手法によりcAMPやCaの局所放出とイオン電流測定が可能となり、嗅覚信号伝達機構の理解が深まります。

嗅神経細胞の繊毛のケージド化合物のフラッシュフォトリシス

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