大動物モデルにおける心血管デバイス用自家血管内皮前駆細胞播種技術と生体適合性試験

本実験の全体的な目的は、血管インプラントに自家血由来の内皮前駆細胞を播種し、大型動物モデルにおける血栓症に対するこの治療の効果を観察することです。これは、ブタから末梢血サンプルを採取して、後期アウトグロース（late outgrowth） porcine 内皮前駆細胞を単離することで達成されます。次に、植込み型デバイスを用います。

概念実証研究では、チタン管に自家PCを充填しました。その後、このデバイスを豚の下大静脈に植え込みました。その結果、コントロール群および閉塞したベアメタル管と比較して、EPCを充填したチタン管の開通性が維持されており、血栓症に対する保護効果があることが示されました。

デューク大学外科は、画期的で革新的な研究の促進に取り組んでいます。以下のプレゼンテーションは、私たちが医学を前進させるために、どのように部署や分野を超えて連携しているかを示す一例です。EK博士は、血管デバイスの血液接触面に患者自身の前駆細胞をライニングすることで血栓症を予防する、細胞シーティング技術の開発に向けた研究を主導してきました。

これらの細胞はインプラントを移植される患者自身から誘導されているため、免疫系による拒絶反応を回避することができます。本研究の成果およびここに記載する手法は、大規模なチームの共同努力によるものです。外科的な移植の手順については、血管外科部門のSean Gage、デューク大学医学部の学生であるWhitney Lane、および私によって実演します。

それでは、バイオメディカルエンジニアリング学科の博士課程学生であるAlexander Janssen氏に、細胞播種プロセスについて詳しく解説していただきます。ここでは、ブタモデルへの移植直前に、血液由来の内皮前駆細胞をチタンチューブに播種する方法を実演します。この手法は概念実証として機能し、同様の基本原理をニチノールステントや機械的循環補助装置など、他の多くの植込み型デバイスに適用することが可能です。EPCsは、ブタ血液の単核細胞分画を播種することで単離され、通常は約7日後に出現します。

これらは、典型的な石畳状の形態によって識別できます。培養液中でEPCsを合計900万個まで増殖させます。準備したEPCsを無血清培地で2回洗浄し、標識中および標識後の光への曝露を制限するように注意してください。

次に、蛍光ラベルのPKH 26で細胞を覆い、適用した溶液量を記録します。細胞を室温で4分間インキュベートします。1分後、染色溶液と同量の豚血清を加えて、標識反応を停止させます。

混合溶液を完全増殖培地で1対1に希釈します。次に、液体を吸引し、完全増殖培地で細胞を3回洗浄し、続いてカルシウムおよび塩化マグネシウムを含まないDPBSで2回洗浄します。その後、使用した液量を記録しながら細胞にトリプシンを加え、37 °Cでインキュベートします。

3分間のインキュベーション後、顕微鏡を用いて細胞が剥離したことを確認し、剥離していれば、添加した量の2倍のトリプシン中和溶液を加えます。トリプシン処理後、細胞溶液を1本のチューブにまとめ、ヘモサイトメーターで細胞密度を測定します。最後に、細胞懸濁液を遠心してペレット化し、少なくとも 4.5 milliliters の無血清培地で細胞を再懸濁します。

豚の手術準備が完了したら、15番のメスを用いて第2乳腺から正中線を切開します。電気凝固器を使用して、最後から2番目の乳腺まで慎重に切開を進めます。腹壁筋膜まで剥離を行います。

蚊針鉗子で腹膜を吊り上げ、メッツェンバウム剪刀で慎重に穿刺します。膀胱を体外に露出させ、膀胱壁に3-0 Vicrylを用いて巾着縫合を施します。中心部を小切開し、16Frのフォーリーカテーテルを切開口から挿入します。その後、手術中の尿量を1 mL/kg/h以上に調整するため、静脈内輸液を行います。

次に、拡張した小腸を体外へ出し、2つのブール外科用リトラクターを配置して腹腔の後面を露出させ、鋭的および鈍的剥離を用いて下大静脈（IVC）を同定します。周囲の組織からIVCを慎重に遊離させます。その後、IVCの分岐部より近位の右腎動脈から、遠位端まで血管を骨格化します。

下大静脈（IVC）の解剖には細心の注意を払ってください。IVCに非常に小さな欠損が生じただけでも、急速な出血を招き、結紮した動物が失血に至る可能性があります。IVCセグメントのすべての側枝を処理してください。特に、IVC分岐部の直近にある2本の大きな後腰静脈の解剖と結紮には細心の注意を払ってください。後側に大きな腰静脈が存在することがよくあります。

この静脈を慎重に剥離し、ベッセルループで固定します。次に、手術と並行して、本手順を開始する前にインプラントへのEPCsの播種を開始します。チタンチューブ組織シーティングスキャフォールドは、完全に組み立てられ、滅菌野で直ちに使用できる状態でなければなりません。

ガス滅菌済みのチタンチューブアセンブリを5 ccシリンジにセットします。次に、5 ccシリンジからプランジャーを取り外しますが、廃棄しないでください。シリンジに固定用キャップを取り付けます。ピペットを使用して、シリンジにEPC懸濁液を満たします。

次に、プランジャーを元に戻します。キャップを取り外し、シリンジのルアー端をアセンブリの開いたシリコンチューブに、ぴったりとはまるまで挿入します。その後、細胞溶液をゆっくりと送り、ヘッドピースの頂点に達するまで進めて気泡を除去します。

次に、ルアキャップでアセンブリを密閉し、滅菌グローブの中でテープで固定します。このアセンブリ全体を精密加工されたシリンジホルダーに挿入し、37 °Cのインキュベーターに入れます。ゲージを使用してシーティングチャンバーが水平であることを確認し、緩やかに回転させながらアセンブリをインキュベートします。

下大静脈（IVC）を結紮した後、ブタ1kgあたり100ユニットのヘパリンを投与して手術を続行します。次に、IVCの遠位側でIVCと腰静脈を45度の角度でクランプし、続いて近位側をクランプします。その後、11番メス刃とポットシザーを用いて、近位クランプと遠位クランプの間に4cmの縦方向の静脈切開を加えます。

IVC内の血液をすべて排出し、内腔を滅菌DPBSで洗浄します。次に、細胞の乾燥を防ぎ、空気を排除するために、EPCを播種したインプラントまたはベアメタルコントロールをIVCに挿入します。IVCに塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含むDPBSを満たします。

次に、4-0プロリンの連続縫合で静脈切開部を閉鎖し、近位側のクランプを1つ外して、少量の逆流（バックブリーディング）により下大静脈（IVC）内の空気を抜きます。空気が抜けたら、遠位側のクランプを外してインプラントを固定します。静脈壁を貫通しているPVCチューブにステイ縫合を施します。

CT針に装着したOPDSを用いて筋膜を閉鎖します。次に、2-0 Vicrylを用いて皮下組織を連続縫合で閉鎖します。その後、皮膚をステープラーで閉鎖します。

切開部位に沿って0.25% Marcaineを最大20 milliliters皮下投与し、疼痛緩和のため創傷部位をガーゼとTegadermで覆う。必要に応じてflu Nixonおよびoxymorphoneを皮下投与する。麻酔を終了し、豚が覚醒したら、その後7日間にわたってケージに戻す。

抗生物質予防投与としてatriを24時間ごとに投与し、術前に貼付したフェンタニルパッチが合計3日間密着していることを確認してください。3日後、設置したチタンチューブインプラントを取り出し、内表面を観察しました。550 nmの励起波長下で、別のチューブにおいて蛍光標識された細胞の融合層が確認されました。

細胞境界を可視化するため、切片細胞を血小板内皮細胞接着マーカーでさらに染色しました。この手順では、多種多様な染色法を使用することが可能です。対照的に、未処理のチタンチューブインプラントは、下大静脈の血栓形成傾向がある低せん断環境において完全に閉塞します。

画像AおよびCに示されているように、細胞が配置されたチタンチューブは画像Bに示されており、凝血物は認められませんでした。末梢血を用いた分離手順に従った結果、培養開始から平均7日後にEPCが出現しました。手術操作においては、IVCを慎重かつ穏やかに骨格化することが非常に重要です。なぜなら、IVCまたはその分枝にわずかな裂傷が生じただけでも、豚の失血死に至る可能性があるためです。この手順に続き、血栓形成を防ぐために、他の血液接触材料を速やかに内皮化させることができます。

例えば、我々のEPCを用いた血管内皮ステントは、血管壁の本来の内腔を模倣し、留置後のステント再狭窄や血栓症を防止できる可能性があります。我々の迅速被覆技術（quick see technology）を用いることで、手術室やカテーテル検査室において、患者自身の血液由来の内皮前駆細胞を用いて、数分以内に血管内デバイスの内腔を被覆することが可能になります。したがって、長期間のex vivo培養は不要となります。

デバイス自体の拘束時間を回避することで、この技術の臨床応用への移行が現実的になります。