Name: マウス胚の運動ニューロンのレクチンに基づく分離と文化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぶマウス胚運動ニューロンのレクチンを用いた分離培養法。脊髄から単離し純化することで、運動ニューロン疾患の研究や生存メカニズムの解析に有用な高純度培養系を確立します。

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私たちは、優れた技術サポートのためにサンドラBar​​genに感謝。この作品は、タンパク質の研究部門（PRD、TP A1.2（RCおよびTS）、およびRUB研究フォンド、Rektoratsprogrammeによってサポートされていました - 。wissenschaftlicher Nachwuchs（AK）モノクローナル抗体は39.4D5とF55A10発達研究ハイブリドーマから得られた銀行（DSHB、アイオワシティ、アイオワ州）。

特殊な試薬の場合：タブを参照してください。 1。記載されているその他すべての試薬はシグマアルドリッチから得られた細胞培養グレードの品質にあります。 1。料理/カバースリップのPORN-H/lamininコーティング<ol><li> 150mMのホウ酸緩衝液pH 8.35で0.5 mg / mlのポリ- DL -オルニチン臭化水素酸塩（PORN - H）のワーキング溶液を調製します。 <ol><li> 50mgのポルノ/ 1mlのホウ酸緩衝液の原液は事前に準備し、-20℃で保存することができます</li></ol></li><li> 100％エタノールで炎でガラスカバースリップを滅菌し、空気乾燥してみましょう。 </li><li>一晩4十分なPORN - Hソリューション℃の表面を覆う</li><li>翌日に滅菌水と空気乾燥カバーグラスで3回洗浄する。 </li><li> HBSSで2.5μg/ mlのラミニンのワーキング溶液を調製<ol><li>アリコートを-20℃で保存することができます° C使用直前に4で解凍。 </li></ol></li><li>ラミニン溶液によるPORN - H -コーティングされたカバースリップの表面をカバーし、それらを使用するまで室温で少なくとも2時間インキュベートすることができます。 </li></ol> 2。精製プレートのレクチンコーティング<ol><li>滅菌水に10 mMトリス、pH 9.5の溶液を調製します。 </li><li> 10μg/ mlの終濃度にレクチンを（HBSSでレクチン（シグマL9640）粉を解決する）を追加します。 </li><li>コー​​トは、レクチン溶液8mlを持つ10cmの細胞培養皿の表面と、それが室温で少なくとも30分間インキュベートてみましょう。 </li><li> HBSS、使用するまでHBSS中の店でプレートを3回洗浄する。 </li><li> 30mMのKClを、0.8％（w / v）の塩化ナトリウムを脱分極-溶液を調製します。室温（RT）でろ過し、店舗によって滅菌する。 </li></ol> 3。運動ニューロン培養培地<ol><li>融解のウマ血清一晩4℃、55℃で失活℃で30分間、-20 5ml及び店舗に分注し℃に室温で使用する前に直接アリコートを解凍。 </li><li>ストア-20℃で1ミリリットルaliqoutsでB27 -サプリメント使用直前に室温でB27のサプリメントを解凍。凍結と融解を避けてください。 </li><li>アリコート-20℃で0.5 mlのアリコートとストアへのグルタミンとは1:100で、それを使用してください。 </li><li> 0.1％BSAと滅菌水で10μg/ mlのCNTFのストック溶液を調製。 -20℃で保存</li><li> 2.5ミリリットルウマ血清1mlのB27 -サプリメントとは直接使用前に0.5ミリリットルグルタミンと46ミリリットルneurobasalメディアを混在させること。 </li><li> 37℃に10 ng / mlの培地とプレ暖かい培地の最終濃度にCNTF追加</li></ol> 4。脊髄の解剖<ol><li> E12.5妊娠マウスを犠牲にし、慎重に胚を削除します。完全に胚をカバーするのに十分なRT HBSSを追加。 </li><li>頭部と尾部を取り外し、またがって手足と胚の背側を上に置きます。 </li><li> one鉗子で胚を固定し、他の鉗子と外側の皮を取り除く。 </li><li>その下に鉗子を刺すことによって脊髄を取り出して、脊髄の両側にのこぎりのような動きでそれを持ち上げます。 </li><li> HBSSで新しい皿に分離された脊髄を転送し、背側の脊髄の中心的なチャネルを開きます。 </li><li>脊髄を囲む髄膜を除去することによって、後根神経節を削除します。 </li><li>準備が完了するまで氷上で1 mlのHBSSとストアでいっぱいエッペンドルフ反応管のレクチンプレート当たり6胚までの脊髄の腰の部分を集める。 </li></ol> 5。レクチンベースの精製により、運動ニューロンの濃縮注：ここに最新の、次の手順を開始する前に培地を調製し、prewarm（ステップ3を参照。） <ol><li> 4℃-20℃と融解℃で保存、100mlのHBSSで1グラムトリプシンを解くことによってトリプシン溶液を調製します</li><li>ミックス1グラム98ミリリットルのHBSSと1 M HEPES pH7.4の液2mlとトリプシンインヒビターは、1mlのアリコートを4℃で保存してください。 </li><li>細胞培養フードに脊髄にチューブを移し、慎重にHBSS 700μlを削除します。 </li><li> 7.5μlのトリプシン溶液と慎重にチューブを転倒混和する。 </li><li> 37℃で8分間trypsinationを実行℃に</li><li> 30μlのトリプシンインヒビターを加えることによって反応を停止し、それ以上の細胞の集合体が見えるようになるまで1000μlのピペットの先端で慎重に10から15回までピペッティングし、ダウン（粉薬）。 20〜200μlをピペットと対応するチップで粉砕を繰り返します。 </li><li> HBSSで満たされたレクチンプレートに細胞溶液をピペットでゆっくりと板を回転させることによって細胞を分散させる。 </li><li>振動のない表面上に室温で60分間レクチンプレートを保管してください。汚染を避けるために、それをカバーしています。 </li><li>非常に穏やかにHBSSを削除し、細胞断片および接続/未接続のないセルを削除するには、予め温めておいたHBSSでプレートを慎重に4回洗浄する。 </li><li>すぐに最後の洗浄ステップの後、プレートに500μlの脱分極のソリューションを追加し、それが1分インキュベートてみましょう。 </li><li>振って、レクチン結合細胞の剥離を促進し、プレートをタッピング。 </li><li> 2ミリリットル予め温めておいた培地及び15 mlファルコンチューブに移すとプレートを埋める。 </li><li>ノイバウアー計数チャンバーで細胞の数を数えます。 </li><li>プレートアプリケーションに応じて、適切な数のラミニンコートしたカバースリップまたはプレート上に細胞。 </li><li> 1日目と、古い培地の50％を慎重に交換してその後隔日で培地交換を行います。予め温めておいた、作りたての新しい培養液を常に使用します。 </li></ol> 6。代表的な結果： 胚の運動ニューロンはE12にE14でのマウスの胚から得ることができる。腰部脊髄の総細胞集団の2-3％は、運動ニューロンで構成され、後根神経節の神経細胞が同様にNTR陽性P75であるとして、それは（レクチンベースpreplatingの手順を開始する前に、これらの細胞を取り除くことが重要です。概要については図1と図2を参照）。第二に、髄膜は、それらが適切にレクチンベースpreplatingの手順（図2および図3）で除去することはできないとして、同様に除外されるべき強く分裂細胞が含まれています。さらに悪いケースでは、これらの細胞は培養プレートを生い茂るできます。図3B及び3Dの代表的な写真も（プロトコールのステップ5.9を参照）が実行されている手順を洗浄後に低細胞密度についての印象を与える。胎児マウスの運動ニューロンの培養は、通常最大5または7日間維持されています。この期間中に細胞が最大長（図4）に彼らの神経突起を確立する。神経突起の長さが強くプレート8上の基板に依存する。典型的な基質は、ポルノ- H覆われた培養皿上に被覆されたラミニンです。運動ニューロンは、また、水の溶解8で生成される細胞外マトリックスのように、他の以下の定義された基板上に出成長することができます。次善のコーティングのケースでは、神経突起の長さと成長円錐の面積が減少し、細胞死は通常、増加している。栄養サポートは、培養中のマウス胎児の運動ニューロンの生存に重要な役割を果たしている。栄養サポート6なしの10％から20％へ7日目ドロップで最初に播種した細胞の生存。脳由来神経栄養因子（BDNF）と毛様体神経栄養因子（CNTF）は、最も一般的に使用される要因ですが、他はよく[白血病阻害因子（LIF）、Cardiotrophin - 1（CT - 1）、塩基性線維芽細胞成長因子は、（bFGFのように生存を促進することができる）、インスリン様成長因子1（IGF - 1）9]。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 胎児マウスの運動ニューロンの準備のための図1。フロースキーム。回路図の描画は、マウス胚の運動ニューロンの単離および培養のためのさまざまな手順を示しています。略語：SC：脊髄、HBSS：ハンクス平衡塩溶液、MN：運動ニューロン。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2 E12.5マウスから脊髄の腰部分の分離：。。E12.5マウス胚。次のステップのために、頭部と尾部を除去し、本体は背アップ位置Bに配置されます：背アップの位置に胚。脊髄の左右にあるピンセットは、その位置での胚の体を固定している。鉗子の一つは、その後、その位置に胚を固定するために使用されるスキンをカットすると、脊髄の下に他をカットするために使用されるC：。E12.5マウス胚から隔離された脊髄は。脊髄（腰椎、胸椎、頚椎）の部分が示されている。脊髄は、髄膜および後根神経節の一部はまだそれらにアタッチするに囲まれているDが：。脊髄は、長手方向に中心管に向かってそれを開くために背側にカットされ、E：。腹側の髄膜が今では平坦化された脊髄から分離してください。注：オフ撮影中に、腰の部分が小さなカットによってマークされているFが：。脊髄の腰の部分だけを、さらに手続きのために取られる。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3決定及びE12.5マウス胚の腰部脊髄からの膵島陽性細胞の分離：。。膵島- 1 / 2抗体の胚の腰部脊髄内のラベル運動ニューロンの列（赤、矢印）およびヘキスト社のラベルのすべてセクション内の核。 E12.5 lumar脊髄の断面。 E12.5マウス胚では、標準的な手順によれば、6時間の4％パラホルムアルデヒド中で浸固定リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、ショ糖で処理した。 20μmの凍結切片をクリオスタットで採取し、切片は標準的な手順11に従ってimmunhistochemical染色のために処理されていました。その後、細胞核の局在化のためにヘキストで標識されたセクションのウェア。なお、後根神経節ニューロンだけでなく、準備の手順は、単離手順からこの組織の部分が除外されるというIslet-1/2-positiveですB：。膵島- 1 / 2とラベル付けされたが（赤、矢印）E12から解離した腰部脊髄細胞。 5胚、左 - 前と右 - レクチンベースpreplating後。細胞はすべての細胞核を可視化するヘキストで対比染色したC：。レクチンベースpreplating前後Islet-1/2-positive細胞の定量D：E12.5胚からNkx6.1ラベル付け運動ニューロン培養で1日後。細胞はすべての核をcisualiezeにヘキストで対比染色した。すべての細胞の90％はNkx6.1陽性であることに注意してください。略語：SC：脊髄、MN：運動ニューロン、DRG：後根神経節。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4 E12.5マウスの運動ニューロンの特徴づけとB：。。エンリッチは腰部脊髄運動ニューロンが in vitro で 0日（0div）にし 、in vitro（2div） の 2日目のP75 NTRを表現E12.5マウスを単離した。細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、続いて標準的な手順にしたがってp75のNTRのために染色した。細胞はすべての核を可視化するヘキストを用いて対比染色したCが：。エンリッチの運動ニューロンをPORN - Hとラミニン上でin vitroで 5日間（5div）後の培養基質として、β- III -チューブリンのためのCNTFのステンドグラスの存在下で行われる。細胞は長い神経突起を成長していることに注意してくださいと長い方（分岐）プロセスと1つ以上の短いプロセス（軸索と樹状突起）で典型的な運動ニューロンの形態が表示されます。略語：MN：運動ニューロン、DIV：in vitroでの日。 <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="3"> レクチンベースpreplatingなし解離後 </td></tr><tr><td> 細胞/ SCの合計数 </td><td> トリパンブルー陽性細胞[％] </td><td> Islet-1/2-陽性細胞[％] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 995.0 </td><td> 13,1 </td><td> 9,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 889.4 </td><td> 8,0 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1.180.0 </td><td> 11,0 </td><td> 10,8 </td></tr><tr><td> 平均 ± SDを</td><td> 1.021.0 ± 147.1 </td><td> 10,7 ± 2,6 </td><td> 10,1 ± 0,7 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td> レクチンベースpreplating付き </td></tr><tr><td> preplating / SC後の細胞の数 </td><td> トリパンブルー陽性細胞[％] </td><td> Islet-1/2-陽性細胞[％] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 189.6 </td><td> 9,9 </td><td> 70,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 168.8 </td><td> 3,7 </td><td> 76,1 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 125.0 </td><td> 0,0 </td><td> 72,5 </td></tr><tr><td> 平均 ± SDを</td><td> 161.1 ± 33.0 </td><td> 4,5 ± 5,0 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> 表1。特にこの目的のために3種類の分離法から段階E12.5から、マウス胚の運動ニューロンの代表的な分離手順の要約。結果は、合計数値またはパーセンテージの数値± SDとして与えられる。略称：SC：脊髄、SD：標準偏差。 <table border="1"><tbody><tr><td> p75のパン[％]と膵島- 1 / 2陽性細胞 </td><td> レクチンベースのパン[％]と膵島- 1 / 2陽性細胞 </td></tr><tr><td> 92,0 ± 3,5 1 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> 表2。レクチンベースおよびp75 - 1から始まるパン運動ニューロンの細胞数の比較。結果はパーセンテージの数値± SDとして与えられる。

<ol><li>Vallstedt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+repressor+activity+assign+redundant+and+specific+roles+to+Nkx6+genes+in+motor+neuron+and+interneuron+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification.</a> Neuron. 31, 743-755 (2001).</li>
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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このレクチンベースpreplating手法の利点は、P75 NTRベースのパンの手順よりも安価であることである、とレクチンは抗体よりも安定しています。図に示されている濃縮。 2とタブ。手順は、細胞のこれらの細胞の大部分が運動ニューロンのマーカー膵島- 1 / 2を発現していることを同じような数字の精製を可能にすることが図1に示す。最も重要なステップは、腰部脊髄の分離手順です。髄膜とDRGS（図2）を削除すると、レクチンベースpreplatingによって、次の精製工程のために不可欠です。これが正しく管理されている場合は、ほとんどすべての細胞は、p75 NTRを （代表的な画像のための図3aを参照）を発現。腰椎運動ニューロンは、差動膵島- 1 / 2 10の上位と下位のレベルを表現するため膵島- 1 / 2の発現およびp75 NTRとの間の違いの理由はおそらくです。我々は正対負のセル（表1）に対して厳しいあったとして膵島- 1 / 2の発現の低レベルの場合、これはimmuncytochemical染色し、その後のカウントで我々の注意を脱出したかもしれない。さらに、表1から明らかな細胞が不可逆的に損傷していることを示すほんのトリパンブルーの陽性細胞が存在するとして、分離した細胞が正常な状態で手順を生き残ることを示しています。この変化をもたらすの手順では、また、マウス胎児からの混合遺伝子型の同腹仔の単胚とそれゆえの運動ニューロンの分離が可能になります。結論として、P75 NTR抗体を用いたパンニング手順には、この代替手段6は、可能なアプリケーションの範囲の点で類似していない場合は同一の能力を有しており、マウス胚の運動ニューロンのための安価で効率的な代替精製法を提供する。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ポリ- DL -オルニチン臭化水素酸塩</td><td>シグマ</td><td> P8638 </td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>インビトロジェン</td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> GIBCO </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td>ガラス製カバースリップ</td><td>サーモ</td><td></td><td> Ø 10または14ミリメートル</td></tr><tr><td>レクチン</td><td>シグマ</td><td> L5142 </td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿</td><td>ヌンク</td><td> 150350 </td><td> Nunclonデルタ面</td></tr><tr><td>馬血清</td><td> Linaris </td><td> SHD3250ZK </td><td>各バッチは、ミネソタ州の文化のためにテストする必要があります</td></tr><tr><td> B27サプリメント</td><td> GIBCO </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td>グルタミン</td><td> GIBCO </td><td> 35050-038 </td><td></td></tr><tr><td> CNTF </td><td>シグマ</td><td> N0513 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Applichem </td><td> A1391 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> GIBCO </td><td> 21103-041 </td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td></td><td></td><td>ステンレススチール、サイズ4または5 </td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>ワージントン</td><td> LS003707 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシンインヒビター</td><td>シグマ</td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td>抗膵島- 1 </td><td> DSHB </td><td> 39.4D5 </td><td>細胞の培養上清</td></tr><tr><td>抗Nkx6.1 </td><td> DSHB </td><td> F55A10 </td><td>細胞の培養上清</td></tr><tr><td>抗P75 NTR </td><td>アブカム</td><td> Ab8874 </td><td></td></tr></tbody></table> 表3。特異的な試薬や機器の表。

マウス胚の運動ニューロンのレクチンに基づく分離と文化

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

脊髄運動ニューロンは、初期胚神経系の発達を通じて分裂の段階に向けて開発し、続いて樹状突起と軸索を成長する。エクスプレスNkx6.1は脊髄運動ニューロン1のユニークな前駆細胞であることを神経管の神経上皮細胞。分裂の運動ニューロンは、その最終的な位置に向かって移動し、脊髄路2,3に沿って列に自分自身を整理するのに。すべてのこれらの差別化と位置付け運動ニューロンの90％以上は、転写因子の膵島1 / 2を表現する。彼らは、手足の筋肉だけでなく、体のそれらと内部器官を刺激する。なかでも、運動ニューロンは通常、脳由来神経栄養因子（BDNF）とニューロトロフィン-3（NT - 3）、トロポミオシン関連キナーゼBとC（TrkBは、TrkC）に対する高い親和性受容体を発現。彼らは、トロポミオシン関連キナーゼ（であるTrkA）4を発現しない。二つの高親和性受容体の横に、運動ニューロンは低親和性神経栄養因子受容体p75のNTRを表現してください。 P75 NTRは、成熟した神経栄養因子を結合する高親和性受容体よりもすべてのニューロトロフィンに似ていますが、低い親和性ですべての神経栄養因子を結合することができる。胚の脊髄内で、p75をNTRはもっぱら脊髄運動ニューロン5で表される。これは、周囲のセル6の大部分から細胞を浄化する運動ニューロンの単離技術を開発するために使用されています。 NTRが単一の実験に使用される抗体の量として高価な方法であることが判明しているp75の細胞外ドメインに対する特異的抗体（パン）の助けを借りて運動ニューロンを単離することにより、パンのために使用されるプレートの大きさに高いです。はるかに経済的な代替は、レクチンの使用です。レクチンは、特に同様に7 P75 NTRに結合することが示されている。次のメソッドは、代わりにp75のNTRの抗体のpreplating手順については、小麦胚芽凝集素を使って別の方法を説明します。レクチンは、p75 NTR抗体に非常に安価な代替品であり、レクチンを用いた精製グレードは、p75 NTR抗体のそれに匹敵する。胚の脊髄からの運動ニューロンは、この方法で単離し生き残ると神経突起を成長することができます。

脊髄から、マウス胚性運動ニューロンを分離する別の方法が説明されています。方法は、考慮にレクチンが低親和性神経成長因子受容体p75NTRにバインドすることができるという事実を取ります。このレクチンベースpreplatingはp75NTRに対する特異的抗体を持つと同様の精製が可能になります。

脊髄運動ニューロンは、胚発生初期の神経系発達を通じてポストミトーシス（有糸分裂後）段階へと分化し、その後、樹状突起および軸索を伸長させます。

この手順の全体的な目的は、濃縮されたマウス胚運動ニューロン培養細胞を得ることであります。まず、妊娠マウスを安楽死させ、胚を取り出し、腰髄を切り出します。次に、酵素処理と一定時間の処理を行い、脊髄を単一細胞懸濁液に解離させます。続いて、レクチンを用いた精製を行い、細胞残渣から運動ニューロンを分離します。次に、総細胞数を算出した後、あらかじめコードを記入したディッシュまたはカバーガラスに細胞を播種します。最終ステップとして、実験手順に応じて培養密度を調整します。最終的に、培養細胞が成長するにつれて、成功すれば典型的な運動ニューロンの形態が観察されます。マウス運動ニューロンの培養準備においては、異なる材料、物質、および溶液を検討することが不可欠です。細胞はこれらの変更に対して敏感に反応する可能性があるためです。RNAまたはタンパク質を単離するために、運動ニューロンを高密度で培養することができます。しかしながら、細胞が活性化したニューロンネットワークを構築し、その結果、トラフィックサポートに依存せずに生存する可能性があります。そのため、RNAまたはタンパク質解析を行う場合には、細胞を低密度で培養した方が望ましい場合があります。この手順の実演を行うのは、当研究室の大学院生であるRebecca ConradとTerza Japanです。まず、pH 8.35の150 millimolar bide bufferを用いて、0.5 milligrams per milliliterのpoly DL ornithine hydrobromide作製し、この溶液をろ過滅菌します。次に、100%ethanolで火炎滅菌してガラスカバースリップを滅菌します。その後、カバースリップを自然乾燥させ、表面に十分な量のporn H溶液を塗布して、4 degree Celsiusで一晩置いた後、翌日に使用します。滅菌水で3回洗浄します。その後、風乾させます。2.5 µg/mLの作業溶液を調製します。HBSS中のラミニン溶液を用いて、ポリL-リシン（poly-L-lysine）でコーティングしたカバーガラスの表面を覆います。その後、使用時まで室温で少なくとも2時間インキュベートします。次のステップは、滅菌水を用いてpH 9.5の10 mM Tris溶液を調製することです。溶液をろ過した後、レクチンを最終濃度 10 micrograms per milliliter になるように混合物に添加します。次に、10 centimeter の細胞培養ディッシュの表面を 8 milliliters のレクチン溶液でコーティングし、室温で少なくとも 30 minutes インキュベートします。続いて、プレートを HBS S で 3 times 洗浄し、使用時まで HBSS 中で保存します。その後、30 millimolar の塩化カリウムと 0.8% の塩化ナトリウムを用いて脱分極溶液を調製します。次に、この混合液をろ過滅菌し、室温で保存します。本手順を開始するために、馬血清を 4 °C で一晩解凍します。その後、55 °Cで30分間加熱して不活化し、5 mLずつ分注して-20 °Cで保存します。使用直前に1アリコート分を室温で解凍してください。次に、B 27サプリメントを1 mLずつ分注し、-20 °Cで保存します。使用直前に室温で融解してください。凍結融解サイクルを避けるため、グルタメートを0.5 mLずつ分注し、-20 °Cで保存します。次に、滅菌水および0.1%BSAを用いて、10 µg/mLのCNTFストック溶液を調製し、-20 °Cで保存してください。最後に、46 mLのニューロベーサル培地に、2.5 mLの馬血清、1 mLのB 27サプリメント、および0.5 mLのグルタミン酸を混合します。さらに、培地の最終濃度が10 ng/mLとなるようにCNTFを直接添加します。これを37 °Cに予熱してください。この時点で、妊娠12.5日のマウス胚を摘出し、胚を慎重に取り出します。胚が完全に浸るように室温のHBSSを加え、胚を1つ顕微鏡下に移動させます。次に、頭部と尾部を除去し、四肢を広げた状態で胚を背面側に向けた状態で配置します。次に、一方のピンセットで胚を固定し、もう一方のピンセットで外皮を除去します。その後、脊髄の下にピンセットを差し込み、脊髄の両側をのこぎり状に動かしながら持ち上げて、脊髄を取り出します。単離した脊髄を、HBSSが入った新しいディッシュに移します。脊髄の背面から中心管を開きます。次に、脊髄を包む髄膜を除去することで、後根神経節を取り出します。その後、脊髄を1 mLのHBSSを満たしたEOR反応チューブに移します。脊髄消化の準備が整うまで、それらを氷上に保持します。脊髄の入ったチューブを細胞培養フードへ移動させます。次に、HBSSを700 µL慎重に除き、あらかじめ付属論文の記載通りに調製しておいた1%解凍トリプシン溶液を7.5 µL加えます。チューブを慎重に転倒混和して混ぜ合わせます。37 °Cで8分間トリプシン処理を行います。その後、37 microlitersのトリプシンインヒビターを添加して反応を停止させ、1000 microliterピペットチップを用いて、細胞凝集塊が見えなくなるまで10〜15回慎重にピペッティングします。その後、20〜200 µL ピペットを使用して同様の操作を繰り返します。細胞懸濁液をHBSSで満たしたレクチンプレートに分注し、プレートをゆっくりと回転させて細胞を分散させます。コンタミネーションを防ぐためレクチンプレートに蓋をし、室温の振動のない場所に60分間静置します。HBSSを非常にゆっくりと除去し、プレートを予熱したHBSSで4回慎重に洗浄して、細胞碎片や未接着細胞を除去します。最後の洗浄ステップの直後、30 mM塩化カリウムおよび0.8%塩化ナトリウムを含む脱分極溶液を500 µLプレートに加え、1分間インキュベートします。プレートを振ったり叩いたりして、レクチン結合細胞の遊離を促進させます。プレートに予熱した培地を2 mL満たします。その後、15 mLファルコンチューブに移します。Neubauer型血球計数器を用いて細胞数を計測します。次に、ラミニンでコーティングしたカバーガラスまたはプレートに細胞を播種します。1日目、およびその後2日ごとに培地を交換し、古い培地の50%を、あらかじめ加温し新鮮に調製した培地で慎重に置換します。ここに示されている画像は、細胞核の局在を標識するためにherstを用いた、胚12.5日の腰髄の横断面である。矢印は、eyelet one two抗体で標識された胚腰髄内の運動ニューロンカラムを示している。これは、eyelet one twoで標識された解離細胞の一例である。レクチンを用いたプリプレーティングの前後の胚12.5日目の腰髄脊髄細胞を、それぞれ左パネルと右パネルに示します。レクチンを用いたプリプレーティング前後のEyelet 1, 2陽性細胞の定量結果をここに示します。こちらは、濃縮された運動ニューロンを示す例です。0日目と2日目の細胞を4%パラアルデヒドで固定し、続いてP75 NTRで染色しました。標準的な手順に従い、in vitro で 5 日間、培養基質として porn H およびラミネートを用い、さらに $\beta$3-tubulin 染色のために CNTF を添加して培養した後、すべての核を可視化するためにフックを用いて対比染色を行いました。細胞は長い neurite を伸展させ、1 本の長い突起と 1 本以上の短い突起を持つという、典型的な運動ニューロンの形態を示しました。運動ニューロンは、すべての脊椎動物および無脊椎動物の体において中心的な役割を果たしています。この分離法は、運動ニューロンの生存メカニズムを解析する上で非常に有用です。分離した細胞を用いることで、相互作用する他の細胞、タンパク質、炭水化物の活性を選択的に解析でき、また、これらの細胞の生存や神経成長に対する薬理学的物質の影響を検討することが可能です。

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Research

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Neuroscience

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