培養アストロサイトにおける貨物の細胞内輸送の可視化

培養皿内のカバーガラス上のマウス初代星状細胞の接着培養から始めます。

無傷の細胞膜を横切って星状細胞に入る蛍光酸性プローブでインキュベートします。

プローブは、酸性エンドリソソーム小胞内に選択的に蓄積し、小胞を蛍光標識して輸送を監視します。

洗浄して余分なプローブを取り除き、新鮮な培地を加えます。

培養物を共焦点顕微鏡下に置き、単一細胞に焦点を合わせてタイムラプスイメージングを行います。

標識された貨物を核周囲領域、

細胞質ゾル、および星状細胞突起

内に分布する蛍光点として視覚化します。

Z軸に沿って複数の焦点面をキャプチャして、3次元セルボリューム全体で貨物を視覚化します。

定義された間隔でイメージングを実行して、星状細胞内のさまざまな深さでの細胞内貨物輸送を追跡します。

貨物の動きを解析し、静止貨物、細胞周辺に向かって移動する貨物、核に向かって移動する貨物を区別します。

イメージングの30分前に、適切なリソソーム標識プローブを200マイクロリットルのアストロサイト培地で1マイクロモルの作業濃度に希釈し、プローブでアストロサイトを摂氏37度で30分間標識します。次に、温かい星状細胞培地で細胞を1回洗浄し、洗浄液をイメージング培地と交換します。

プローブ標識の直後に、アストロサイト培養容器を顕微鏡ステージの適切なアダプターに入れます。そして、落射蛍光を使用して、蛍光タンパク質またはプローブを発現する細胞を見つけます。デジタルカメラを使用して蛍光サンプルの照明を調整して選択したセルを視覚化し、フォーカスを調整して1つのセルにズームインします。

次に、ズーム機能と明確フォーカス機能を使用して、300秒から500秒の範囲の時間間隔で、2秒ごとに1フレームの頻度で単一のCスタックタイムラプスシリーズを取得します。タイムラプス画像をAviまたはTIFFスタックファイルとして保存およびエクスポートします。