Name: ヒト乳腺線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の実験的生成（CAFS） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: 学ぶ ヒト乳腺線維芽細胞から癌関連線維芽細胞（CAFs）を実験的に生成する方法。共同移植腫瘍異種移植モデルを用いて、マイオ線維芽細胞の獲得と腫瘍進行における役割を解明します。

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我々は、この原稿の重大な編集にはこの作業の寛大な支援と監督のロバートA.ワインバーグ（ホワイトヘッドバイオ医療研究所、ケンブリッジ）と氏キーランMellody（マンチェスター大学、マンチェスターの）感謝。このプロジェクトは、研究英国（CR -英国）承認番号C147/A6058（AO）によってサポートされていました

1。初代培養ヒト正常乳腺線維芽細胞の分離初代培養ヒト正常乳腺線維芽細胞を単離するための実験手順を図で説明されています。 1A。 <ol><li>以前に12を説明するように、細胞解離バッファーを準備します：10％ウシ胎児血清（FCS）、ペニシリン-ストレプトマイシン（200単位/ ml）、コラゲナーゼタイプI（1 mg / ml）を、ヒアルロニダーゼ（とダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を125単位/ ml）。 </li><li>削減乳房形成（〜0.5グラム）、リン酸の数倍は緩衝生理食塩水（PBS）から解剖乳房組織を洗浄する。無菌かみそりの刃を使用して小さな断片（&lt;1.5 mm 3の ）に組織をミンチ。 </li><li>上記の細胞解離バッファー（組織の0.5グラムあたり10ml）と最高速度で1分間ボルテックスの適切な量を含む15 mlのコニカルチューブに組織片を移す。 </li><li>細胞解離バッファーfの組織断片を消化または12月18日37時間℃でゆっくりと撹拌しながら。依然としてチューブに残っている未消化の組織片の多くの部分があることに*注意。 </li><li>撹拌せずに室温で5分間チューブをインキュベートします。 5ミリリットル血清学的ピペットを使用して、新しいコニカルチューブに生じる間質細胞の濃縮上清を移す。 </li><li> 250 × gで5分間、間質フラクションを遠心し、PBSで細胞ペレットを再懸濁します。 250 × gで5分間、再び遠心し10％FCSを含むDMEMで細胞ペレットを再懸濁します。文化37 15センチメートルペトリ皿に10％FCSを含むDMEMで細胞は℃、5％の二酸化炭素。 </li><li>コンフルエントになるまで細胞を伝播する。それは通常8-10日かかります。 -80細胞を° Cで保存凍結培地（10％ジメチルスルホキシドおよびDMEMに20％FCS）を使用。オリジナルの株式を5凍結バイアルを準備。 1バイアルを解凍し、5個体群内で継代線維芽細胞を含む二次株式を5バイアルを準備するために細胞を拡大するその後の実験のための倍加（PD）に。これらの手順は、拡張された組織培養中に発生することができるクローン選択と文化のストレスを最小限に抑える。P1.1 - 7はまた、乳房切除術12で得られた乳癌からCAFSを切り離すために使用されることができるのでご注意ください。 </li></ol> 2。 GFP標識、ピューロマイシン耐性、不死化したヒト正常乳腺線維芽細胞の世代<ol><li> P1.7で単離された初代ヒト正常乳腺線維芽細胞）をimmortaliseに、テロメラーゼとGFPの両方を発現するレトロウイルスpMIG（MSCV - IRES - GFP）ベクトル12を 、ご紹介。 4-5日の培養細胞をしてから、GFP陽性細胞をフローサイトメトリーを用いてソートする。 </li><li> GFPで標識された不死化線維芽細胞にピューロマイシン耐性遺伝子をコードする構築レトロウイルスpBabe -プーロをご紹介。文化ピューロマイシンの存在下で5〜7日間（最終濃度：1μg/ mlの）のための細胞がGFP陽性（GFP +）、ピューロマイシン耐性（プーロRを分離する</li><li>次に、これらの線維芽細胞は、GFPとピューロマイシン耐性をコードする遺伝子の水平伝達につながることができるアクティブなウイルスを作り出すかどうかを調べるために、2日間6センチメートルシャーレ内2.5x10 5 GFP +プーロR不死化したヒト乳腺線維芽細胞を成長させる。 </li><li>フィルタメディアは、シリンジフィルター（孔径：0.45μm）を使用して、これらの線維芽細胞によって調整し、ウイルス感染の効率を高めるプロタミン硫酸塩の存在下で12時間のための10T1 / 2マウス繊維芽細胞（5μg/ ml）を上に追加します。培地は、その後さらに2日間、10％FCS - DMEMに変更されます。 </li><li>蛍光顕微鏡で細胞を調べます。 GFPウイルスに感染10T1 / 2細胞ではGFP陽性になります。 5-7日間ピューロマイシン（1μg/ ml）を持つ細胞も扱い、あらゆるプーロR 10T1 / 2細胞はピューロマイシンの治療後に存在し、フォームコロニーであればプレートを観察。 </li><li>なお、水平遺伝子トランジスタ親のGFP +プーロRヒト乳腺線維芽細胞によって産生さアクティブなウイルスによってsferは、腫瘍の異種移植片内の周囲のマウス細胞および/ ​​または癌細胞GFP +プーロRを行うことがあります。これは、腫瘍の異種移植片から最初に注入されたGFP +プーロRヒト乳腺線維芽細胞を単離するプロセスの妨げになる場合があります。 </li></ol> 3A。免疫不全マウスに乳癌細胞とヒト乳腺線維芽細胞の共射出 EXP - CAFSを生成するための実験手順を図に示します。 1BA。 <ol><li>ミックス1 × 10 6 MCF - 7 - rasのヒト乳癌細胞と3 × 6 GFP +プーロR、P2.2で生成された不死化ヒト乳腺線維芽細胞）。 50％（v / v）の注入あたりの​​マトリゲルで培養液400μlの細胞を準備します。 </li><li>免疫不全ヌードマウスに皮下細胞の混合物を注入する。 CAFSは異なるから独立して抽出されている場合腫瘍は、いくつかのマウスの右と左脇腹に各混合物を移植。 </li></ol> 3B。免疫不全マウスにヒト乳腺線維芽細胞の注入<ol><li> EXP - CAFSに対する制御の線維芽細胞を生成するには、50％（v / v）のマトリゲルあたりの注入（図1BB）で培養液400μlにP2.2に生成された3 × 10 6 GFP +プーロR不死化したヒト乳腺線維芽細胞を準備します。癌細胞と線維芽細胞を混合しないでください。 </li><li>ヌードマウスの皮下部位にP3b.1で準備した線維芽細胞を移植する。 </li></ol> *接種線維芽細胞が皮膚の下に線維芽組織ではなく、腫瘍を形成することに注意してください。 4A。腫瘍の異種移植片の解剖<ol><li>皮下ヒト乳癌異種移植を保有するマウスの42日後移植（図1BAを）Euthanise。際に他の癌細胞および/ ​​または線維芽細胞がcoimplantedされていること*注、線維芽細胞は、それらの筋線維芽細胞表現型を開始するために腫瘍の異種移植片内でより長い42日間インキュベートする必要があります。 </li><li>鉗子とハサミを用いて鈍的切開によるマウスの横腹から腫瘍の異種移植片を採取する。 PBSで腫瘍組織を浸す。 </li></ol> 4B。線維芽細胞の異種移植片の解剖<ol><li>線維芽細胞の異種移植42日後移植（図1BB）を抱いてマウスをEuthanise。 </li><li>鉗子やハサミを使用して皮下線維芽細胞の異種移植片を解剖。 PBSに線維芽組織を置く。小さな透明な組織として表示される線維芽細胞の異種移植は、皮膚の下を探すのは難しい場合がありますのでご注意ください。 </li></ol> 5。異種移植片からの初代培養細胞の調製<ol><li>腫瘍（〜0.5グラム）または線維芽組織（〜0.1グラム）を解剖するために無菌生物学的安全キャビネットを使用してください。 15cmの文化Dの最上位に摘出した組織を転送する1mlのPBSでっぽい。無菌かみそりの刃を使用して小さな組織片（&lt;1.5 mm 3の ）に組織をミンチ。 *線維芽細胞の異種移植片は、以下の0.1グラムの重さなら、いくつかの追加の線維芽細胞の異種移植片を収集し、単離のためのセルの数を増やすために、それらを一緒に混ぜることに注意してください。 </li><li>細胞解離バッファー（組織の0.5グラムあたり10ml）と最高速度で1分間ボルテックスを含む15 mlのコニカルチューブに組織片を移す。 </li><li> 37℃で3時間細胞懸濁液をインキュベート°、連続、低速撹拌しながらC。 </li></ol> 6。培養中のピューロマイシン耐性細胞の分離<ol><li> 250 × gで5分のための腫瘍または線維芽細胞異種移植片のいずれかから解離細胞懸濁液を遠心し、PBSで細胞ペレットを再懸濁します。 250 × gで5分間遠心する10％FCS - DMEMで得られた細胞ペレットを再懸濁します。 37ピューロマイシン存在下（1μg/ mlの）で15センチメートルペトリ皿° Cで培養細胞をあらゆる汚染癌細胞および/またはマウス間質細胞を除去するために、5％の二酸化炭素。コンフルエント（2-4週間）になるまで細胞を伝播する。 -80細胞を° Cで保存凍結培地を使用して。 *注その結果プーロR細胞 、指定された42日齢のEXP - CAF1（図1BA）またはコントロール線維芽- 1細胞（図1BB）、不滅とGFPの陽性である。それは、P2.3 - 6で説明したように、これらの細胞は、10T1 / 2細胞を使用して、アクティブなウイルスを作り出すかどうかを確認することをお勧めします。 </li></ol> 7A。文化におけるEXP - CaF2薄膜の細胞の単離さらにCAFSの活性化筋線維芽細胞表現型を増強するため、42日齢のEXP - CAF1 MCF - 7 - rasの細胞と細胞を混合し、200日の追加期間のヌードマウスに皮下再度注入する。細かく分析し、ピューロマイシン（1μg/ mlの）の存在下で10％FCS - DMEMで15センチメートルペトリ皿の中で単一細胞懸濁液と培養細胞への腫瘍の異種移植片を解離させ、ようにP6に示す0.1。コンフルエント（8-10日）まで、細胞を伝播する。 -80細胞を° Cで保存凍結培地を使用して。結果プーロR細胞は 242日齢のEXP -フッ化カルシウムの細胞（図1BA）という名前が付けられます。 図7b。文化のコントロール線維芽- 2細胞の抽出 EXP - CaF2薄膜細胞に対する制御の線維芽細胞を生成するには、200日間、さらにヌードマウスに皮下癌細胞なしで単独で42日齢のコントロール線維芽- 1細胞​​を注入する。としてP6.1で示されたピューロマイシンの存在下で10％FCS - DMEMで15センチメートルペトリ皿中の細胞を（1μg/ ml）を摘出し、単一の細胞懸濁液と文化に線維芽組織を解離する。コンフルエント（3-4週間）になるまで細胞を伝播する。 -80細胞を° Cで保存凍結培地を使用して。結果プーロR細胞はコントロール線維芽細胞- 2細胞（図1BB）という名前が付けられます。 8。代表的な結果： コントロール線維芽細胞- 2、EXP - CaF2薄膜セル乳房の腫瘍の異種移植片から抽出されているlsは、、人間を示す、人間特有のビメンチン、プロリル-4 -ヒドロキシラーゼ、コラーゲン1A、フィブロネクチン、S100A4、および線維芽細胞の表面タンパク質（図2A）11を含む間葉系マーカー、のために強く陽性に染色起源とこれらの細胞の間葉系の性質。対照的に、サイトケラチン、上皮細胞のマーカーは、これらのGFP +繊維芽細胞（図2B）で染色されなかった。これらの知見は、したがって、抽出されたEXP - CaF2薄膜および制御線維芽- 2細胞は、最初にマウスの異種移植片に導入された親のヒト乳腺線維芽細胞から発信されていることを示唆している。 重要なのは、EXP - CaF2薄膜の細胞の割合が高く、α- SMAと42日齢のEXP - CAF1とコントロール線維芽- 2細胞（図に比べて筋線維芽細胞のマーカーが、どちらも細胞外マトリックス糖タンパク質テネイシン- C 5、のために陽性に染色。2C、D）11。これらのデータは、その居住者、人間の乳腺fibrを示しているoblastsは徐々に腫瘍異種移植片内でCAFの筋線維芽細胞へと進化。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> ヒト乳腺線維芽細胞の分離の図1の模式図。 A）削減乳房形成組織は無菌かみそりの刃（P1.2）を使用してミンチと15 mlコニカルチューブ（P1.3）に移した。小さ ​​な組織片を細胞解離バッファー（P1.4）で消化し ​​、in vitro（P1.5 - 7） で培養のために調製した。 、隔離された一次ヒト乳腺線維芽細胞、テロメラーゼとGFPの両方を発現するレトロウイルスpMIG（MSCV - IRES - GFP）ベクトルを、immortaliseには導入され、その結果、GFP陽性細胞はフローサイトメトリー（P2.1）を用いて選別した。ピューロマイシン耐性遺伝子をコードするレトロウイルスpBabe -プーロのベクトルは、これらの細胞に導入した。ピューロマイシンの治療時に、GFP -標識（GFP +）ピューロマイシン耐性（ピューロR）、immortalisedのヒト乳腺線維芽細胞は、（P2.2）を単離した。 BAは）EXP - CAFSを生成するには、GFP +プーロRはヒト乳腺線維芽細胞を免疫不全ヌードマウス（P3A）の皮下にMCF - 7 - rasの乳癌細胞でcoinjectedされた不死化。腫瘍の異種移植は、移植後42日（P4A）で切除し、単一細胞懸濁液（P5）に解離した。これらの細胞は、任意の混入癌細胞とマウス間質細胞（P6）を排除するためにピューロマイシンの存在下でin vitroで培養した。結果としてピューロマイシン耐性細胞は、実験的に生成されたCAF1（EXP - CAF1）細胞と呼ばれた。これらの細胞は、切除42日移植後は、再びMCF - 7 - rasの細胞と混合し、（P7a）前と同じように、ホストマウスに皮下移植した。結果腫瘍は200日の追加期間増殖させ、その後解剖、解離、およびピューロマイシンの存在下で培養した。孤立ピューロマイシン耐性細胞は、EXP -フッ化カルシウムの細胞（242日齢）と呼ばれた。 EXP - CAFSに対するコントロール細胞を単離するためにはBB）は 、GFP +プーロR不死化したヒト乳腺線維芽細胞は、MCF - 7 - rasの細胞（P3B）なしで純粋培養としてヌードマウスに皮下注射した。解剖線維芽組織は、42日後移植（P4Bは）、、コントロール線維芽細胞- 1細胞​​という名前の単細胞懸濁液（P5）およびピューロマイシン耐性細胞に解離前述のように（P6）を単離した。これらの線維芽細胞は、再び200日（P7B）のためにさらにMCF - 7 - rasの細胞なしでヌードマウスに皮下移植した。線維芽組織の解離、解剖、およびピューロマイシンの存在下で培養した。分離されたピューロマイシン耐性細胞は、コントロールの線維芽細胞- 2細胞を（242日齢）と呼ばれた。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2 <st exp cafs caf2>。（B）とは対照的に、汎サイトケラチン、上皮細胞のマーカー、GFP（緑）を発現するEXP - CaF2薄膜細胞では検出されていません。細胞核は、4' - 6 -ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）（青）で染色されています。スケールバーは50μm（小島らから呼ばれる。11） </st> （C）EXP - CaF2薄膜の細胞とα- SMA（赤）またはテネイシンC（TN - C）（赤）に対する抗体を使用してコントロール線維芽- 2細胞（コントロールF.）の免疫蛍光。細胞核はDAPI（青）で染色されています。スケールバーは50μm。EXP - CaF2薄膜セルの（D）48％は1、一方、α- SMA陽性の染色42日齢のEXP - CAF1の4％、対照線維芽細胞- 2細胞集団の2.5％がα- SMAが陽性です。 （小島ら11から参照される）

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

CAF -特異的マーカーとCAFSの間で観察された不均質性のレベルの欠如は、この細胞型自体の課題の特性評価をレンダリングする。 in vitroで研究するCAFSはまた、これらの細胞が老化し、長期間培養すると増殖が停止する追加の合併症によって妨げられている。直接レトロウイルステロメラーゼcDNA構築物を使用して、プライマリCAFSをimmortaliseに私たちの以前の試みは失敗しました。したがって、さらにこれらの細胞の特性を促進する腫瘍を調べるために、我々は、coimplantationの腫瘍の異種移植モデルを用いてヒト乳腺線維芽細胞から不死化CAFSを生成する手法を開発した。削減乳房形成組織から抽出した主要なヒト乳腺線維芽細胞は、マウスに乳癌細胞を注入される前に不死化された。ヒト線維芽細胞は、結果の腫瘍異種移植片（詳細は図1BAを参照）から分離された。重要なことは、ヒト乳腺線維芽細胞は、ますます電子腫瘍の進行の過程で筋線維芽CAFSを促進腫瘍にvolved。または70日齢のEXP - CAF1細胞と制御性線維芽細胞- 2細胞11 -我々は確かに242日間-古いEXP - CaF2薄膜の細胞が...

<table border="1"><tr><td> 材料名 </td><td> タイプ </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> DMEM </td><td></td><td>インビトロジェン</td><td> 61965-026 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td></td><td> GIBCO </td><td> 10270 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td></td><td>インビトロジェン</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼI型</td><td></td><td>シグマ</td><td> C0130 - 1G </td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td></td><td>シグマ</td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td>ビメンチン（V9）抗体</td><td></td><td> Novocastra研究所</td><td> NCL - L - VIM - V9 </td><td></td></tr><tr><td>テネイシンC（BC - 8）抗体</td><td></td><td></td><td></td><td>からの贈り物 博士<stroNG&gt;ルチアーノ Zardi </td></tr><tr><td> α- SMA - Cy3の（1A4）抗体</td><td></td><td>シグマ</td><td> C6198 </td><td></td></tr><tr><td>プロリル-4 - ヒドロキシラーゼ</td><td></td><td> Dako社製</td><td> M0877 </td><td></td></tr><tr><td> （5B5）抗体</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンタイプ1の1A抗体</td><td></td><td>シグマ</td><td> HPA011795 </td><td></td></tr><tr><td>汎サイトケラチン抗体</td><td></td><td>シグマ</td><td> C5992 </td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン抗体</td><td></td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 610077 </td><td></td></tr><tr><td> S100A4/FSP-1（線維芽細胞特定のタンパク質- 1）抗体</td><td></td><td> Dako社製</td><td> A5114 </td><td></td></tr><tr><td>線維芽細胞表面タンパク質 （クローン1B10）抗体</td><td></td><td>アブカム</td><td> ab11333 </td><td></td> &lt;/ TR&gt; <tr><td> MSCV - IRES - GFPコンストラクト</td><td></td><td></td><td></td><td>作家へのお願い</td></tr><tr><td> pBabe -プーロ構造</td><td></td><td></td><td></td><td>購入 Addgeneから</td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td></td><td>シグマ</td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td></td><td>シグマ</td><td> D9564 </td><td></td></tr><tr><td> 15 mlコニカルチューブ</td><td></td><td>コー​​ニング</td><td> 430766 </td><td></td></tr><tr><td>ヌードマウス</td><td></td><td>タコ</td><td> NCRNU - F </td><td>女性のNCRヌード</td></tr><tr><td> C3H/10T1/2細胞</td><td></td><td> ATCC </td><td></td><td> CCL - 226 </td></tr></table>

ヒト乳腺線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の実験的生成（cafs）

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

癌は、腫瘍細胞と&quot;質&quot;と呼ばれる非癌コンパートメントで構成される複雑な組織です。間質は、細胞外マトリックス（ECM）と1-3線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞と白血球を含む間葉系細胞が、様々な構成されています。 腫瘍関連間質には、近隣の癌細胞から放出される実質的なパラクリン信号に応答する。病気のプロセスの間、間質は、しばしば筋線維芽細胞の多数を含む、癌関連線維芽細胞（CAFS）によって人口になります。これらの細胞は、以前はそれらのin vitroでの培養のためのヒト癌の多くの異なる種類から抽出されています。 CAFSの亜集団は、4,5、そのα-平滑筋アクチンのアップレギュレーション（α- SMA）の発現を介して識別可能である。これらの細胞は、筋線維芽細胞Cと同様の性質を共有する&quot;活性化線維芽細胞&quot;の特徴です。ommonly負傷したと線維性組織6で観察された。この筋線維芽CAFのサブセットの存在は非常に高品位な悪性腫瘍に関連し、患者の予後不良に関連付けられています。 私たち自身を含む多くの研究室では、、CAFS、免疫不全マウスに癌細胞を注入、大幅に腫瘍形成7-10を促進することができることが示されている。癌患者から調製CAFSは、しかし、頻繁に継続的な実験を通してそれらの使用の広範さを制限する文化の伝播中に老化を受ける。この困難を克服するために、我々はcoimplantationの乳房の腫瘍の異種移植モデルを用いて、実験的にヒト乳腺線維芽細胞から不死化したヒト乳腺CAF細胞株を（EXP - CAFS）を生成するための新しい技術を開発。 EXP - CAFSを生成するためには、リダクションの乳房形成組織から得られた親のヒト乳腺線維芽細胞は、最初immortaliいたテロメラーゼ、テロメラーゼホロ酵素の触媒サブユニット、およびGFPを発現し、ピューロマイシン耐性遺伝子に設計さとSED。これらの細胞は、マウス異種移植に活性化rasがん遺伝子（MCF - 7 - rasの細胞）を発現するMCF - 7ヒト乳癌細胞でcoimplantedていた。 in vivoでのインキュベーション期間の後、最初に注入されたヒト乳腺線維芽細胞は、それらのピューロマイシン耐性11に基づいて腫瘍の異種移植片から抽出された。 我々は、筋線維芽細胞表現型を採用し、常駐ヒト乳腺線維芽細胞が分化したことを観察し、腫瘍の進行の過程で腫瘍促進特性を取得した。重要なことは、これらの細胞は、EXP - CAFSとして定義されて、密接に患者から切除した乳癌から分離されたCAFSの腫瘍促進筋線維芽細胞表現型を模倣する。私たちの腫瘍異種移植片由来のEXP - CAFSしたがって人間breasでCAFSの生物学を研究するために効果的なモデルを提供tの癌。記述されたプロトコルはまた、ヒト癌の他の型から派生した様々なCAFの集団を生成し、特徴付けるために延長することができる。

腫瘍間質内に存在する筋線維芽細胞の豊富な癌関連線維芽細胞（CAFS）、腫瘍の進行を推進する上で重要な役割を果たす。我々は実験的にヒト乳腺線維芽細胞からCAFSを生成するためのcoimplantation腫瘍xengraftモデルを開発した。プロトコルは、腫瘍形成を促進する能力を身CAFの筋線維芽細胞を確立する方法について説明します。

ヒト乳腺線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の実験的生成（CAFS）

癌腫は、腫瘍細胞と「ストロマ（間質）」と呼ばれる非癌性コンパートメントから構成される複雑な組織です。ストロマは以下で構成されています...

このビデオでは、ヒトの原代培養細胞から癌関連線維芽細胞（CAF）を生成する手順について説明します。線維芽細胞癌は、腫瘍細胞と、ストロマ（間質）と呼ばれる非癌性コンパートメントで構成される複雑な組織です。腫瘍関連ストロマは、細胞外マトリックスと、線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、周細胞、白血球を含む多様なストロマ細胞で構成されています。癌関連線維芽細胞には、腫瘍内に存在する活性化線維芽細胞の特徴である筋線維芽細胞が豊富に含まれています。ストローマ細胞は、腫瘍の進展を促進させる重要な役割を担っています。これらの細胞は、まず縮小乳房形成術で得られた健常な乳腺組織から初代ヒト乳腺線維芽細胞を単離することで、in vitroで作製できます。得られた組織を単一細胞懸濁液に解離させた後、ウイルス導入により不死化させ、GFPおよびピューロマイシン耐性遺伝子を発現するようにエンジニアリングします。次に、これらの細胞をヒト乳癌MCF7細胞と共に、免疫不全マウスの皮下に共注入します。注入されたヒトメモリ線維芽細胞は、腫瘍促進性のCAF筋線維芽細胞へと分化します。次に、親株のヒト乳腺線維芽細胞を腫瘍ゼノグラフトから抽出し、ピューロマイシン存在下で培養します。得られたピューロマイシン耐性細胞は、実験的生成CAF（exp CAF）と呼ばれます。免疫組織化学的解析により、当初存在していた正常なヒト乳腺線維芽細胞が、腫瘍ゼノグラフト内で腫瘍形成を促進する能力を獲得したCAF様筋線維芽細胞へと分化したことが明らかになります。乳がん患者から一次CAFを抽出するなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、腫瘍の共植去によってヒト乳腺線維芽細胞から実験的にCAFを生成できる点にあります。手順のデモンストレーションを行う総合的なモデルは、私の研究室の博士研究員であるKarと、同研究室の博士課程学生であるAhmed Karが担当します。縮小乳房形成術で切除された、1 gの健康なヒト乳腺組織から開始します。組織をPBSで数回洗浄し、15 cmのペトリ皿に入れ、滅菌済みのカミソリを用いて、1.5 mm³未満の小さな断片に細切します。次に、カミソリを使用して組織片を15 mLコニカルチューブに移します。チューブには、組織0.5 gあたり10 mLの細胞解離バッファーを入れておきます。その後、最大速度で1分間ボルテックスします。チューブを37 °Cのインキュベーター内のロッカーに設置し、12〜18時間かけて組織片を消化させます。翌日、チューブ内には依然として多くの未消化の組織片が残っています。まず、最大速度でボルテックスした後、チューブをベンチトップに置き、攪拌せずに室温で5分間インキュベートします。インキュベート後、5 mLの生理学的ピペットを用いて、得られたストローマ細胞濃縮上清（SUP natant）を新しいコニカルチューブに移します。次に、ストローマ画分を250 ×gで5分間遠心分離します。遠心後、細胞ペレットをPBSで再懸濁し、再び250 ×gで5分間遠心分離します。その後、ペレットを10% FCSを添加したDMEMで再懸濁し、15 cmのペトリ皿に移します。細胞を37°C、5%二酸化炭素条件下で培養します。8〜10日後には、細胞がコンフルエントになるはずです。この時点で細胞を回収し、長期保存のために凍結することができます。単離したヒト正常記憶線維芽細胞の初代培養細胞を不死化させるため、H turtとGFPの両方を発現するレトロウイルスP MIGベクターを導入します。細胞を4〜5日間培養した後、フローサイトメトリーを用いてGFP陽性細胞をソートします。次に、ピューマイシン耐性遺伝子をコードするレトロウイルスP babe puroコンストラクトを、GFPで標識された不死化線維芽細胞に導入します。最終濃度1 µg/mLのピューマイシン存在下で、細胞を5〜7日間培養します。GFP標識されたピューマイシン耐性不死化ヒトメモリ線維芽細胞を単離します。次に、これらの線維芽細胞が、GFPおよびピューマイシン耐性をコードする遺伝子の水平伝播を引き起こし得る活性ウイルスを産生するかどうかを検討します。6 cmペトリ皿で、2.5×10⁵個のピューマイシン耐性不死化ヒトメモリ線維芽細胞を2日間培養します。線維芽細胞の条件化培地を回収し、孔径0.45 µmのシリンジフィルターでろ過します。次に、これを10.5T2マウス線維芽細胞に添加し、ウイルス感染効率を高めるために5 µg/mLの硫酸プロテアーゼ存在下で12時間培養します。12時間経過後、培地を10% FCS添加DMEMに交換し、さらに2日間培養します。蛍光顕微鏡で細胞を観察します。GFPウイルスに感染した細胞の10分の1から半分程度がGFP陽性となります。次に、1 µg/mLで細胞を処理するために培地を交換します。ピューマイシンを5〜7日間加えます。再度、蛍光顕微鏡で細胞を観察し、ピューマイシン耐性の細胞がコロニーを形成しているかを確認します。親株であるピューマイシン耐性GFP標識ヒト乳腺線維芽細胞によって産生された活性ウイルスによる水平遺伝子伝播により、周囲のピューマイシン感受性マウス細胞および癌細胞が耐性を獲得する可能性があることに注意してください。腫瘍ゼノグラフト内でピューロマイシン耐性とGFP陽性であることを確認します。これにより、免疫不全マウスへの注入用癌関連線維芽細胞を実験的に作製するため、腫瘍ゼノグラフトから注入したGFP標識ピューロマイシン耐性ヒト乳腺線維芽細胞を単離するプロセスが妨げられる可能性があります。まず、準備したばかりのヒト乳腺細胞株とヒト乳癌細胞株MCF7をトリプシン処理し、新しいマイクロチューブ内で細胞数をカウントすることから始めてください。1 × 10⁶個のMC77 RAヒト乳癌細胞と、3 × 10⁶個のGFP標識pur-mycin耐性不死化ヒト乳腺線維芽細胞を、1回あたりの注入量として50% Matrigelを含む400 µLの培地で再懸濁します。対照群として、チューブを氷上に置きます。同様に、MCF seven RAs細胞を含まないヒト乳腺線維芽細胞も準備します。次に、27ゲージの針を用いて、細胞混合液を免疫不全ヌードマウスの皮下に注入し、CAFの表現型の腫瘍内変動を調べます。少数の異なる腫瘍異種移植片から、CAFおよび対照線維芽細胞を単離します。次に、各混合物を各マウスの右側と左側の部位に移植します。注入後、腫瘍または線維芽細胞の異種移植片を42日間成長させます。腫瘍異種移植片内における線維芽細胞のインキュベーション期間は、腫瘍内での親線維芽細胞が獲得した筋線維芽細胞の表現型に基づいて最適化する必要があります。安楽死させたマウスからカルフ（calfs）または対照線維芽細胞を抽出するために、少なくとも0.5 gのゼノグラフト組織と、少なくとも0.1 gの線維芽細胞ゼノグラフト組織を別々のディッシュに配置します。次に、滅菌済みカミソリを用いて、組織を1.5 mm³未満の小さな組織片に細切にします。その後、カミソリを用いて組織片を細胞解離緩衝液を含む15 mLコニカルチューブに移し、最大速度で1分間ボルテックスします。細胞懸濁液を37 °Cで3時間、継続的にゆっくりと攪拌しながらインキュベートし、その後、細胞懸濁液を遠心分離します。腫瘍またはファイバーグラスサノグラフトから分離し、250 ×gで5分間遠心分離します。細胞ペレットをPBSに再懸濁し、遠心分離を繰り返します。その後、得られた細胞ペレットを10% FCSを添加したDMEMに再懸濁し、ピューロマイシン耐性親株ヒト乳腺線維芽細胞培養を単離します。腫瘍または線維芽細胞由来の細胞を、1 µg/mLのピューロマイシン存在下、37 °C、5% CO₂の条件下で15 cmペトリ皿を用いて浮遊培養します。これにより、混入した癌細胞および／またはマウス細胞を除去します。ストロマ細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、凍結保存液を用いて-80 °Cで保存します。得られたピューロマイシン耐性細胞（42日齢XP calf 1またはコントロール線維芽細胞1細胞と指定）は不死化しており、GFP陽性であることに注意してください。ヒト記憶線維芽細胞は、腫瘍の進行過程で癌細胞と相互作用することにより、腫瘍異種移植内での腫瘍促進的な筋線維芽細胞表現型を増強させます。1×10⁶個のMCF-7 RA細胞と3×10⁶個の42日齢P calfを混合します。1.5 mLのエッペンドルフチューブ内で、50% Matrigelを添加した400 µLの培地にcalc-1細胞を懸濁させ、パワーインジェクションを行います。また、calc-1細胞の腫瘍促進的な筋線維芽細胞形質をさらに増強させるため、癌細胞を含まない42日齢のコントロール線維芽細胞3 × 10⁶個をエッペンドルフチューブに準備します。これらの細胞とCF7RA細胞の混合液をヌードマウスに皮下注射します。必要に応じて、対照群とするため、癌細胞を含まないコントロール線維芽細胞のみを単独で注射します。腫瘍促進性の筋線維芽細胞表現型を強化するため、腫瘍異種移植後のexp calf one細胞をさらに200日間インキュベートし、exp C two細胞を作製します。また、対照群として、癌細胞を含まないcontrol fibroblasts one細胞をマウスに注入し、腫瘍を除去して組織培養皿に回収することで、exp calf two細胞に対する対照となるFibroblasts two細胞を作製します。腫瘍または線維芽細胞ゼノグラフトを解剖・解離して単一細胞懸濁液にし、培養します。10% F-C-S-D-M-E-Mにピューマイシンを加えた15cmペトリ皿で細胞を増殖させ、トリプシン処理後に凍結保存液を用いて-80°Cで保存します。得られたピューマイシン耐性細胞を「242 day old exp calf two cells」または「control fibroblasts two cells」と命名しました。GFP標識されたexp calf twoおよびcontrol fibroblasts two細胞を乳腺腫瘍ゼノグラフトから抽出し、免疫組織化学的に解析した結果、この画像に示す通り、ヒト特異的prolyl 4-hydroxylase、collagen one A、fibronectin S 100、A four、およびfibroblast surface proteinを含む間葉系マーカーに対して強い陽性反応を示しました。これらの結果は、これらの細胞がヒト由来であり、間葉系であるという性質を示しています。対照的に、上皮細胞のマーカーであるサイトケラチンは、これらのGFP陽性線維芽細胞において染まりませんでした。以上の結果から、EXP C twoおよびcontrol fibroblasts two細胞は、最初にマウス異種移植に導入された親株のヒト乳腺線維芽細胞に由来することが示唆されます。重要な点として、コントロールの線維芽細胞2細胞と比較して、XPカーフ2細胞では、いずれも筋線維芽細胞のマーカーであるα-SMAおよび細胞外マトリックス糖タンパク質であるtenascin Cに対して陽性に染色される細胞数が大幅に増加していました。また、42日目のXPカーフ1細胞で観察された割合よりも、XPカーフ2細胞においてα-SMA陽性の筋線維芽細胞が高い割合で存在していることに注目してください。これらのデータは、腫瘍ゼノグラフト内において、腫瘍の進行に伴い、常在するヒトメモリ線維芽細胞が徐々にカーフ筋線維芽細胞へと分化したことを示しています。相補腫瘍ゼノグラフトモデルは、腫瘍微小環境を研究する研究者が、正常な線維芽細胞が癌へと進化するプロセスを研究する道を開きました。いわゆる線維芽細胞です。

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腫瘍増殖における癌関連線維芽細胞の役割を調べるためのマウスモデル

本論文は、三重陰性乳癌の同種マウスモデルからの原発性癌関連線維芽細胞の単離と培養と、腫瘍微小環境を標的とするように設計された新規ナノ粒子の前臨床試験への応用を目的とする。...

標的ナノ粒子の研究のための乳癌の同質性マウスモデルからの原発癌関連線維芽細胞の分離

多細胞3D腫瘍スフェロイドを肺腺癌細胞、線維芽細胞、および単球を用いて調製し、続いてこれらのスフェロイドから癌関連線維芽細胞(CAF)を単離した。単離されたCAFを正常な線維芽細胞と比較し、ミトコンドリアの膜貫通電位、活性酸素種、および酵素活性を研究することにより、ミトコンドリアの健康状態を評価しました。...

3D多細胞肺腫瘍スフェロイドから分離された癌関連線維芽細胞におけるミトコンドリアの健康評価

このプロトコルでは、 in vitro/in vivo...

分子および計算研究のためのツールとしてのマウス乳腺腫瘍からの癌関連線維芽細胞

このプロトコルは、根治的前立腺切除術から線維芽細胞を単離、増殖、および不死化するための包括的な手順を提供します。さらに、線維芽細胞と腫瘍細胞のクロストークの機能的効果を評価するために開発されたアッセイについても説明しており、条件付け培地による処理と共培養の両方を利用しています。...

前立腺癌関連線維芽細胞の単離、培養、および特性評価

このプロトコルは、食道扁平上皮癌(ESCC)患者から、がん性オルガノイド、がん関連線維芽細胞(CAFs)、非腫瘍関連線維芽細胞(CF)を同時に分離する方法を説明しています。これらの患者に合わせた材料の採用は、患者間変動の問題を回避し、ESCC研究に適した実験プラットフォームを提供する可能性があります。...

同一食道がん患者からの腫瘍オルガノイド、がん関連線維芽細胞および対応する線維芽細胞の確立

学ぶ ヒト乳腺線維芽細胞から癌関連線維芽細胞（CAFs）を実験的に生成する方法。共同移植腫瘍異種移植モデルを用いて、マイオ線維芽細胞の獲得と腫瘍進行における役割を解明します。

ヒト乳腺線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の実験的生成（CAFS）

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