ヒト乳腺線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の実験的生成（CAFS）

このビデオでは、ヒトの原代培養細胞から癌関連線維芽細胞（CAF）を生成する手順について説明します。線維芽細胞癌は、腫瘍細胞と、ストロマ（間質）と呼ばれる非癌性コンパートメントで構成される複雑な組織です。腫瘍関連ストロマは、細胞外マトリックスと、線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、周細胞、白血球を含む多様なストロマ細胞で構成されています。癌関連線維芽細胞には、腫瘍内に存在する活性化線維芽細胞の特徴である筋線維芽細胞が豊富に含まれています。

ストローマ細胞は、腫瘍の進展を促進させる重要な役割を担っています。これらの細胞は、まず縮小乳房形成術で得られた健常な乳腺組織から初代ヒト乳腺線維芽細胞を単離することで、in vitroで作製できます。得られた組織を単一細胞懸濁液に解離させた後、ウイルス導入により不死化させ、GFPおよびピューロマイシン耐性遺伝子を発現するようにエンジニアリングします。

次に、これらの細胞をヒト乳癌MCF7細胞と共に、免疫不全マウスの皮下に共注入します。注入されたヒトメモリ線維芽細胞は、腫瘍促進性のCAF筋線維芽細胞へと分化します。

次に、親株のヒト乳腺線維芽細胞を腫瘍ゼノグラフトから抽出し、ピューロマイシン存在下で培養します。得られたピューロマイシン耐性細胞は、実験的生成CAF（exp CAF）と呼ばれます。免疫組織化学的解析により、当初存在していた正常なヒト乳腺線維芽細胞が、腫瘍ゼノグラフト内で腫瘍形成を促進する能力を獲得したCAF様筋線維芽細胞へと分化したことが明らかになります。乳がん患者から一次CAFを抽出するなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、腫瘍の共植去によってヒト乳腺線維芽細胞から実験的にCAFを生成できる点にあります。

手順のデモンストレーションを行う総合的なモデルは、私の研究室の博士研究員であるKarと、同研究室の博士課程学生であるAhmed Karが担当します。縮小乳房形成術で切除された、1 gの健康なヒト乳腺組織から開始します。組織をPBSで数回洗浄し、15 cmのペトリ皿に入れ、滅菌済みのカミソリを用いて、1.5 mm³未満の小さな断片に細切します。

次に、カミソリを使用して組織片を15 mLコニカルチューブに移します。チューブには、組織0.5 gあたり10 mLの細胞解離バッファーを入れておきます。その後、最大速度で1分間ボルテックスします。チューブを37 °Cのインキュベーター内のロッカーに設置し、12〜18時間かけて組織片を消化させます。

翌日、チューブ内には依然として多くの未消化の組織片が残っています。まず、最大速度でボルテックスした後、チューブをベンチトップに置き、攪拌せずに室温で5分間インキュベートします。インキュベート後、5 mLの生理学的ピペットを用いて、得られたストローマ細胞濃縮上清（SUP natant）を新しいコニカルチューブに移します。

次に、ストローマ画分を250 ×gで5分間遠心分離します。遠心後、細胞ペレットをPBSで再懸濁し、再び250 ×gで5分間遠心分離します。その後、ペレットを10% FCSを添加したDMEMで再懸濁し、15 cmのペトリ皿に移します。

細胞を37°C、5%二酸化炭素条件下で培養します。8〜10日後には、細胞がコンフルエントになるはずです。この時点で細胞を回収し、長期保存のために凍結することができます。

単離したヒト正常記憶線維芽細胞の初代培養細胞を不死化させるため、H turtとGFPの両方を発現するレトロウイルスP MIGベクターを導入します。細胞を4〜5日間培養した後、フローサイトメトリーを用いてGFP陽性細胞をソートします。次に、ピューマイシン耐性遺伝子をコードするレトロウイルスP babe puroコンストラクトを、GFPで標識された不死化線維芽細胞に導入します。最終濃度1 µg/mLのピューマイシン存在下で、細胞を5〜7日間培養します。

GFP標識されたピューマイシン耐性不死化ヒトメモリ線維芽細胞を単離します。次に、これらの線維芽細胞が、GFPおよびピューマイシン耐性をコードする遺伝子の水平伝播を引き起こし得る活性ウイルスを産生するかどうかを検討します。6 cmペトリ皿で、2.5×10⁵個のピューマイシン耐性不死化ヒトメモリ線維芽細胞を2日間培養します。

線維芽細胞の条件化培地を回収し、孔径0.45 µmのシリンジフィルターでろ過します。次に、これを10.5T2マウス線維芽細胞に添加し、ウイルス感染効率を高めるために5 µg/mLの硫酸プロテアーゼ存在下で12時間培養します。12時間経過後、培地を10% FCS添加DMEMに交換し、さらに2日間培養します。

蛍光顕微鏡で細胞を観察します。GFPウイルスに感染した細胞の10分の1から半分程度がGFP陽性となります。次に、1 µg/mLで細胞を処理するために培地を交換します。

ピューマイシンを5〜7日間加えます。再度、蛍光顕微鏡で細胞を観察し、ピューマイシン耐性の細胞がコロニーを形成しているかを確認します。親株であるピューマイシン耐性GFP標識ヒト乳腺線維芽細胞によって産生された活性ウイルスによる水平遺伝子伝播により、周囲のピューマイシン感受性マウス細胞および癌細胞が耐性を獲得する可能性があることに注意してください。

腫瘍ゼノグラフト内でピューロマイシン耐性とGFP陽性であることを確認します。これにより、免疫不全マウスへの注入用癌関連線維芽細胞を実験的に作製するため、腫瘍ゼノグラフトから注入したGFP標識ピューロマイシン耐性ヒト乳腺線維芽細胞を単離するプロセスが妨げられる可能性があります。まず、準備したばかりのヒト乳腺細胞株とヒト乳癌細胞株MCF7をトリプシン処理し、新しいマイクロチューブ内で細胞数をカウントすることから始めてください。

1 × 10⁶個のMC77 RAヒト乳癌細胞と、3 × 10⁶個のGFP標識pur-mycin耐性不死化ヒト乳腺線維芽細胞を、1回あたりの注入量として50% Matrigelを含む400 µLの培地で再懸濁します。対照群として、チューブを氷上に置きます。

同様に、MCF seven RAs細胞を含まないヒト乳腺線維芽細胞も準備します。次に、27ゲージの針を用いて、細胞混合液を免疫不全ヌードマウスの皮下に注入し、CAFの表現型の腫瘍内変動を調べます。少数の異なる腫瘍異種移植片から、CAFおよび対照線維芽細胞を単離します。

次に、各混合物を各マウスの右側と左側の部位に移植します。注入後、腫瘍または線維芽細胞の異種移植片を42日間成長させます。腫瘍異種移植片内における線維芽細胞のインキュベーション期間は、腫瘍内での親線維芽細胞が獲得した筋線維芽細胞の表現型に基づいて最適化する必要があります。

安楽死させたマウスからカルフ（calfs）または対照線維芽細胞を抽出するために、少なくとも0.5 gのゼノグラフト組織と、少なくとも0.1 gの線維芽細胞ゼノグラフト組織を別々のディッシュに配置します。次に、滅菌済みカミソリを用いて、組織を1.5 mm³未満の小さな組織片に細切にします。その後、カミソリを用いて組織片を細胞解離緩衝液を含む15 mLコニカルチューブに移し、最大速度で1分間ボルテックスします。細胞懸濁液を37 °Cで3時間、継続的にゆっくりと攪拌しながらインキュベートし、その後、細胞懸濁液を遠心分離します。

腫瘍またはファイバーグラスサノグラフトから分離し、250 ×gで5分間遠心分離します。細胞ペレットをPBSに再懸濁し、遠心分離を繰り返します。その後、得られた細胞ペレットを10% FCSを添加したDMEMに再懸濁し、ピューロマイシン耐性親株ヒト乳腺線維芽細胞培養を単離します。

腫瘍または線維芽細胞由来の細胞を、1 µg/mLのピューロマイシン存在下、37 °C、5% CO₂の条件下で15 cmペトリ皿を用いて浮遊培養します。これにより、混入した癌細胞および／またはマウス細胞を除去します。

ストロマ細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、凍結保存液を用いて-80 °Cで保存します。得られたピューロマイシン耐性細胞（42日齢XP calf 1またはコントロール線維芽細胞1細胞と指定）は不死化しており、GFP陽性であることに注意してください。ヒト記憶線維芽細胞は、腫瘍の進行過程で癌細胞と相互作用することにより、腫瘍異種移植内での腫瘍促進的な筋線維芽細胞表現型を増強させます。1×10⁶個のMCF-7 RA細胞と3×10⁶個の42日齢P calfを混合します。

1.5 mLのエッペンドルフチューブ内で、50% Matrigelを添加した400 µLの培地にcalc-1細胞を懸濁させ、パワーインジェクションを行います。また、calc-1細胞の腫瘍促進的な筋線維芽細胞形質をさらに増強させるため、癌細胞を含まない42日齢のコントロール線維芽細胞3 × 10⁶個をエッペンドルフチューブに準備します。これらの細胞とCF7RA細胞の混合液をヌードマウスに皮下注射します。必要に応じて、対照群とするため、癌細胞を含まないコントロール線維芽細胞のみを単独で注射します。

腫瘍促進性の筋線維芽細胞表現型を強化するため、腫瘍異種移植後のexp calf one細胞をさらに200日間インキュベートし、exp C two細胞を作製します。また、対照群として、癌細胞を含まないcontrol fibroblasts one細胞をマウスに注入し、腫瘍を除去して組織培養皿に回収することで、exp calf two細胞に対する対照となるFibroblasts two細胞を作製します。

腫瘍または線維芽細胞ゼノグラフトを解剖・解離して単一細胞懸濁液にし、培養します。10% F-C-S-D-M-E-Mにピューマイシンを加えた15cmペトリ皿で細胞を増殖させ、トリプシン処理後に凍結保存液を用いて-80°Cで保存します。得られたピューマイシン耐性細胞を「242 day old exp calf two cells」または「control fibroblasts two cells」と命名しました。GFP標識されたexp calf twoおよびcontrol fibroblasts two細胞を乳腺腫瘍ゼノグラフトから抽出し、免疫組織化学的に解析した結果、この画像に示す通り、ヒト特異的prolyl 4-hydroxylase、collagen one A、fibronectin S 100、A four、およびfibroblast surface proteinを含む間葉系マーカーに対して強い陽性反応を示しました。

これらの結果は、これらの細胞がヒト由来であり、間葉系であるという性質を示しています。対照的に、上皮細胞のマーカーであるサイトケラチンは、これらのGFP陽性線維芽細胞において染まりませんでした。以上の結果から、EXP C twoおよびcontrol fibroblasts two細胞は、最初にマウス異種移植に導入された親株のヒト乳腺線維芽細胞に由来することが示唆されます。

重要な点として、コントロールの線維芽細胞2細胞と比較して、XPカーフ2細胞では、いずれも筋線維芽細胞のマーカーであるα-SMAおよび細胞外マトリックス糖タンパク質であるtenascin Cに対して陽性に染色される細胞数が大幅に増加していました。また、42日目のXPカーフ1細胞で観察された割合よりも、XPカーフ2細胞においてα-SMA陽性の筋線維芽細胞が高い割合で存在していることに注目してください。これらのデータは、腫瘍ゼノグラフト内において、腫瘍の進行に伴い、常在するヒトメモリ線維芽細胞が徐々にカーフ筋線維芽細胞へと分化したことを示しています。

相補腫瘍ゼノグラフトモデルは、腫瘍微小環境を研究する研究者が、正常な線維芽細胞が癌へと進化するプロセスを研究する道を開きました。いわゆる線維芽細胞です。