$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
共焦点顕微鏡ソフトウェアから始めて、画像取得パラメータを設定します。
次に、スライドガラスに取り付けられたマウスの脳切片を取ります。このセクションは、血液脳関門成分を標的とする抗体で染色されます。
血液脳関門は、恒常性を維持するための血流と脳の間の選択的な細胞界面です。
カバーガラスに希望の屈折率の浸漬油を一滴塗布して、解像度を最適化し、光の屈折を最小限に抑えます。
スライドを顕微鏡ステージに置き、落射蛍光ランプを使用してサンプルを視覚化します。
適切なフィルターを使用して、DAPI染色核を特定し、イメージング用の毛細管セグメントを特定します。
ライブスキャンを開始し、各蛍光チャンネルのパラメータを調整して、高品質の画像をキャプチャします。
最後に、Zスタック取得の開始点と終了点を定義して、血液脳関門の3次元画像を生成します。
顕微鏡を制御するソフトウェアの取得メニューで、画像取得パラメータを設定します。画像サイズのドロップダウンメニューで、1,024 x 1,024ピクセルの値を選択します。[ズーム]メニューの値を調整して、ピクセルサイズを200〜300ナノメートルの値に変更します。
取得速度ドロップダウンメニューで、400ヘルツの値を選択します。次に、[システム設定] メニューでピクセル深度を選択し、値を 12 ビットに変更します。次に、顕微鏡ソフトウェアの[取得]タブで、シーケンシャルフレーム取得のオプションをオンに切り替えます。ピンホールメニューの値を変更して、各チャンネルの光学断面の厚さを0.75〜1マイクロメートルの値に設定します。
カバーガラスの上に屈折率1.52の浸漬油を一滴加え、ガラスカバーガラスと対物レンズの屈折率に一致するように脳セクションを追加します。その後、サンプルを顕微鏡に入れ、落射蛍光ランプを点灯して顕微鏡双眼鏡を使用してサンプルを視覚化します。次に、ボタンを押してライブスキャンモードを開始します。スキャン中は、各チャンネルのゲインとレーザー強度を調整して、画像のダイナミックレンジを最大化し、ピクセルの飽和を回避します。その後、キャピラリーの体積全体にまたがる光学Zスタックを実行するための開始セクションと終了セクションを設定し、0.45マイクロメートルのステップサイズを使用します。
重要なのは、イメージングセッション中は、すべての取得設定を同じに保つ必要があることです。