Name: デジタル免疫蛍光顕微鏡を用いたラット軟膜細動脈におけるエストロゲン受容体-αのイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学ぶデジタル免疫蛍光顕微鏡法によるラット軟膜細動脈におけるエストロゲン受容体-αの可視化技術。低温切片機と抗体染色を用いて、神経血管研究におけるタンパク質局在解析の精度を向上させる再現性の高い手法です。

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このプロジェクトのための作業は、保健R01 - NR5339の国立研究所からの補助金と健康科学 - R061LDの制服サービス大学によってサポートされていました。

1。軟膜動脈の分離と準備<ol><li>ラットは麻酔の挿入であり、1X PBSで1％エバンスブルーと動脈と浸み込ませるにカテーテルを固定しながら。軟膜血管は、エバンスブルー色素がそれらを簡単に分離することでうまく染まる。 </li><li>必要になるまで-70℃で脳や店舗を抽出します。最適に、脳はもう2ヶ月以上保管しないようにしてください。 </li><li>解剖顕微鏡を使用すると、脳の表面から軟膜細動脈（平均直径35〜50μm）を取り外します。慎重に先の細いピンセットを用いて皮質の背側および側面からのすべて青に染色された細動脈をやってのける。固定液に入れる前に余分な接着皮質組織を削除します。 </li><li> 30分間、0.1M PBS中2％冷パラホルムアルデヒドで収穫した細動脈を修正。 </li><li>切片のために動脈を準備するにはディスク凍結/チャック（-20℃で設定）に埋め込む培地を注ぐ。 </li><li>チャック上に平らな場所の細動脈のセクションそれは凍結するためにNDを待つ。しっかりとあなたが直面している動脈の先端でメディアを埋め込むにクライオスタットの冷凍のディスク上に、右の容器を置きます。それがしっかりと凍結されるまで、ピンセットでそれを保持する。 </li><li>クライオスタットのヘッドに容器を凍結ディスクを置き、クライオスタットで8μmの軟膜細動脈のリングをカット。 </li><li>クロム酸カリウム、ゼラチンsubbedスライド上の細動脈のセクションをマウントします。 </li><li> 4℃で一晩冷蔵庫でスライドボックスに準備されたスライドを保管してください。 </li></ol> 2。 ER -α免疫蛍光染色日1 <ol><li>冷蔵庫からスライドを外し、室温にそれぞれをもたらす。 </li><li>スライドを洗浄するには1〜1.5ミリリットル0.1M PBSは（十分なすべてのセクションをカバーする）、10分間座ってドレインを聞かせてさらに2回の手順を繰り返し注ぐ。スライドの各エッジには、疎水性のマーカーを持っています。その結果、液体は、スライドの表面上に残ります。各洗浄に液体が注がれていますアウトと新鮮0.1 M PBSで置き換え。 </li><li>内因性の蛍光を減らすために、室温で30分間50mmの塩化アンモニウム1ml中のスライドをインキュベートする。 </li><li> 0.1M PBS 3 × 10の分でスライドを洗浄します。 2.2で説明するよう</li><li> 0.1％トリトンX - 100に加え、30分間、PBS中の1％正常ヤギ血清（NGS）のブロックスライド。非特異的結合を低減する。 </li><li>一晩4 PBS + 0.1％トリトン- X + 1％NGSで℃、一次抗体（1:500ウサギポリクローナル抗ER -α）でサンプルをインキュベートする</li></ol>日2 <ol start="7"><li>冷蔵庫からスライドを外し、室温にそれぞれをもたらす。 </li><li> 0.1M PBS 3 × 10の分でスライドを洗浄します。 2.2で説明するよう</li><li> 1％NGS、暗所、室温で2時間のための0.1パーセントトリトン- X100 + PBSでオレゴングリーン488二次抗ウサギでインキュベートする。この段階から、次のステップは、暗所で行う必要があります。 </li><li> 0.1M PBS 3 × 10の分でスライドを洗浄します。 2.2で説明するよう</li><li> VEの下でntilatedフード、4'の代わりに1滴、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）を加えた後、マウント船舶上のメディアとサンプルにカバースリップを配置。 </li><li>カバースリップの端を密封するために研磨明確な釘を適用します。約24時間かかりますれ、完全に乾燥するまで、スライドを移動しないでください。 </li></ol> 3。デジタル蛍光イメージング<ol><li>軟膜血管内イメージングER -αのために我々はデジタルカメラを搭載した3色（青、緑と赤）のためのフィルタを使用してニコンEclipseの組み合わせ例デジタル蛍光顕微鏡を使用してスライス。 </li><li>顕微鏡下で染色された軟膜血管のセグメントを持つ準備されたスライドを挿入し、関心の蛍光標識の領域を可視化するために調整する。 X600倍率に増加してX100倍率で起動します。 </li><li>複数のビューを変換するためにDAPI（青）と細胞核（DAPI）とニコン拡張奥行きのフォーカスのソフトウェアを使用して、ER -α（オレゴングリーン）のFITC（緑）のチャンネルで画像をキャプチャするためにカメラを使用して、2次元画像への血管セグメントのの。 </li></ol> 4。代表的な結果： 我々は、ローカライズされた蛍光プローブを使用して軟膜動脈血管におけるエストロゲン受容体-αとデジタル蛍光顕微鏡を用いた受容体の私達の可視化を最適化。受容体の存在を検出するために、ウサギポリクローナル一次抗体およびオレゴングリーン488標識二次抗体は、軟膜動脈の受容体は脳の表面から分離されたイメージに使用されていました。また、核染色（DAPI）細胞核を特定し、ER -αは細胞cyotosolと核に存在することが報告されているので、我々が核にある受容体を検出できるかどうかを判断するために使用された。さらに、我々は一次抗体の特異性を検証し、一次抗体に対する二次の結合を確認するために確証実験を行った。 <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。免疫ER -αの染色（緑）とメスのラットの脳から単離された軟膜動脈のリングにDAPI（青）と対比。図1Aは、いくつかの核内エストロゲン受容体- A（矢印）の存在を示唆してマージされた画像を示しています。図1B及び1Cは、Z -スタック画像の組合せであるER -αの焦点画像です。画像は、X600倍率で撮影し、別の面で同じ容器のカットリングからですした。矢印は、エストロゲン受容体-αを示している。 <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。雌ラットの脳から単離された軟膜動脈のリングでの対照群のための免疫蛍光染色。図2Dは、一次抗体のない容器を示しています。図2Eは、二次抗体（血管内皮側に沿って個別の自家蛍光を注意してください）​​することなく容器を示しています。画像は、X600倍率で撮影してdiffereで同じ容器のカットリングからですられたNTプレーン。

<ol><li>Smiley, D. A., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+compounds%2C+estrogen+receptors+and+vascular+cell+signaling+in+the+aging+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels.</a> Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).</li>
<li>Miller, V. M., Duckles, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+actions+of+estrogens%3A+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Vascular actions of estrogens: functional implications.</a> Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).</li>
<li>Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+effects+of+oestrogen%3A+multiplicity+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Parmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action.</a> Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).</li>
<li>Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forms+of+estrogen+receptor-a+incerebral+blood+vessels%3A+regulation+by+estrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).</li>
<li>Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-dependent+localization+of+estrogen+receptor-alpha%2C+but+not+-beta%2C+in+en+face+arterial+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).</li>
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<li>Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+restores+post-ischemic+pial+and+microvascular+dilation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+and+Circ%22%5BJournal%5D)">Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation.</a> Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).</li>
<li>Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+estrogen+on+postischemic+pial+artery+reactivity+to+ADP%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP.</a> Microcirculation. 16, 403-413 (2009).</li>
<li>Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+restores+postischemic+sensitivity+to+thromboxane+mimetic+U46619+in+rat+pial+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Blood.+Flow.+Metab%22%5BJournal%5D)">Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery.</a> Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).</li>
<li>Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+HET0016+and+estrogen+on+pial+artery+vasodilatory+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEBJ+Abstracts%22%5BJournal%5D)">Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity.</a> FASEBJ Abstracts. , (2007).</li>
<li>Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection%3A+procedures+in+immunohistochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxical.+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies.</a> J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).</li>
<li>Lorincz, A., Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+immunoreactants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specificity of immunoreactants.</a> J. Neurosci. 28, 9083-9086 (2008).</li>
</ol>

見解は著者のものであり、健康科学の制服サービス大学、国防総省、または米国政府の公式政策や立場を反映するものではありません。

以前、我々は一時的なグローバルな虚血性脳損傷後の血管拡張薬7,8および血管収縮剤9の両方に対応して直径を変更するには軟膜動脈の能力が著しく若い卵巣摘出ラットに押されていることを示した。慢性的なエストロゲンの補充は血管運動応答7-9を復元します。さらに、遅延エストロゲン補充は、私たちは長期的なエストロゲンの枯渇がcerebrovasculatureのER -α濃度に影響を与えるかどうか疑問につながる軟膜動脈血管拡張容量10エストロゲンの有益な効果を逆転。我々は、西部は慢性的なエストロゲンの枯渇に応答して、ER -α発現の変化を評価するためにブロッティングと組み合わせた免疫蛍光ラベルを使用する予定です。我々は受容体の離散群の可視化にいくつかの困難があったので、我々はここで発揮する方法を変更。したがって、本研究で私たちの主な目標は、最初のビジュアルを最適化するために比較的簡単な方法を開発することでした軟膜細動脈における受容体の化。いくつかの報告と一致し6,11,12で私たちがプロービングされた組織の種類、試料の厚さ、容器内のER -αの分布だけでなく、非特異的結合の程度を調整することが必要があると認める。 我々の手法は軟膜血管スライスのER -αの存在を可視化する非常に効果的です。しかし、他の人として以前に、興味、固定、ブロッキングプロトコルと組織の処理12のタンパク質の細胞内局在抗体の特異性と濃度に大きく依存するこれらのメソッドの使用が成功して指摘している。私たちの船の準備の可視化の前に我々はすべてのこれらの変数を動作するように時間を費やしました。我々はこの論文で我々のアプローチのいくつかを調整するために必要な方法強調している。 我々は最適軟膜細動脈にER -αを視覚化するために着手し、これにはいくつかの課題を提示。最初に、ラット軟膜動脈の平均サイズはややトリッキーな脳の表面から分離し、除去すること35から50ミクロンの間である。我々は前にエバンスブルー色素とその灌流犠牲にすることが動脈の解離が容易に発見。エバンスブルーは蛍光影響を与える可能性がありますが、我々はこの染料を使用する利点は、そのマイナーな欠点を上回ると感じている。我々のプロトコルでは船が数回洗浄されています。これは、血管内の残留色素を最小限に抑え、蛍光で染色した場合の影響を低減します。我々が遭遇した別の難しさは、軟膜血管セグメントの厚さは、困難な受容体の明確な可視化を行ったということでした。さらに、我々は、ER -αは、いくつかの細胞層全体に分散されたという事実におそらく原因で、特に明確な画像を得ることができなかった。我々は、長手方向の血管のスライス（他の人が持っているとして）で作業しようとしたが、マウント中のため小さい軟膜サイズには、血管を処理し、血管のねじれを防止することは困難であった顕微鏡を使用していても上をスライドします。最後に、我々が正常にクライオスタットを用いて、8μm厚のリングにクロス賢明な容器を切断することにより私たちのテクニックを変更しました。リングは、扱いやすいといくつかのスライドに取り付けることができます。 かつて我々はDanseshatalbと関連付けます（11）で提案された船を固定して組織を凍結最初のフラッシュの効果をテストすることが必要だと感じたの船舶を取得しました。我々はわずかに少ない背景の免疫蛍光法を見つけたが、我々はまた、受容体が少ない激しく受容体の可視化をより困難に染色したと指摘した。その結果、我々は（一般的に1〜2カ月の間に）必要な時まで先制脳全体および店舗を凍結することを好む。我々は、その後、前述のように船をやってのけるし、クリオスタットでスライスする前に船を固定してください。我々はここに示すように。 一必要なステップは別々に一次と二次抗体の両方でコントロールを実行することです特異性とバックグラウンドの免疫蛍光法を決定する。エストロゲン受容体-α抗体は扱いが困難になる可能性があります。私達は私達の体の染色の成功に満足される前に実際には、我々は3つの異なる一次抗体を（1モノクローナルと2ポリクローナル）を試みた。弊社のコントロールの一環として、まず一次抗体の添加の省略によって一次抗体の特異性を検証する。図2Dは、一次抗体なしで容器を示しています。は染色とほんの少しのバックグラウンドシグナルはありません。一次抗体はポリクローナルであるため、一部のびまん性非特異的なバックグラウンド染色があります。第二に、我々は、一次抗体を加え、ではなく、二次抗体（図2E）。一つは、血管の内皮の境界線に沿ってautofluoresenceを表す素敵なマージンを見ることができます。これは、ダンと関連付けます5の仕事と一貫性があります。しかし、どちらのER -αを表す免疫の小さな点、また粒状の外観を参照数多くの受容体の存在ぶ必要がすることは、プライマリとセカンダリの両方の抗体の組み合わせに検出できます。我々は、血管の内皮縁に沿ってautofluoresenceの異なるパターンを指摘した。彼らはER -αに対する抗体の特異性を確認し、二次抗体が一次的に結合すると抗体の特異性のためのこれらの独立したテストは重要です。 結論では、他の4で示すように、5脳の血管は、多数のER -αサブタイプ受容体が含まれています。私たちの手では、分離された軟膜動脈から8μm断面スライスを準備する染色と受容体の可視化を強化。伝統的な方法は、サンプルを検査する共焦点顕微鏡を使用。厚い標本から連続光学切片を表示する能力を持つことは、共焦点顕微鏡の重要な利点です。しかし、良好な共焦点顕微鏡の購入は非常に高価になることができます。拡張奥行き（EDF）ソフトウェアを使用することにより、我々は、ことがわかった当社の機器のコストを減らすことができる。 EDFと蛍光顕微鏡を用いて、我々は、クリアな画像を取得し、Z -スタックを使用して複数のレベルで軟膜動脈のER -αを視覚化することができます。 EDFのソフトウェアの大きな利点は、それが効果的に画像から3次元画像を作成する方法で、画像キャプチャを可能にするということです。 oneの充当ソフトウェアとデジタル蛍光顕微鏡を購入する共焦点顕微鏡へのアクセスや資金を持っていない研究室のために研究者の目標に応じて実践的かつ低コストのオプションがあります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>エバンスブルー</td><td>シグマ</td><td> E - 2129 </td></tr><tr><td> 10 × PBS </td><td>シグマ</td><td> P - 5493 </td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> T353 </td></tr><tr><td>組織- Tek社のOCTコンパウンド</td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td>アンモニウム塩化</td><td>シグマ</td><td> A9434 </td></tr><tr><td>トリトンX - 100 </td><td>シグマ</td><td> T9284 </td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 16210-064 </td></tr><tr><td> ER -αのウサギポリクローナル抗体</td><td>サンタクルス</td><td> H - 184 </td></tr><tr><td>オレゴングリーン488ヤギ抗ウサギIgG </td><td>インビトロジェン</td><td> O - 11038 </td></tr><tr><td> Vectashieldマウントのための培地 DAPIで蛍光</td><td>ベクトルラボ</td><td> H - 1200 </td></tr></tbody></table>

デジタル免疫蛍光顕微鏡を用いたラット軟膜細動脈におけるエストロゲン受容体-αのイメージング

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

血管反応性に対するエストロゲンの影響の多くは、エストロゲン受容体1、2、3との相互作用を介して媒介される。 2つのサブタイプ（エストロゲン受容体αとβ）が存在するが、エストロゲン受容体-αは平滑筋の両方で、共焦点レーザー走査顕微鏡4と組み合わせて蛍光染色を使用して軟膜動脈セグメントの内皮細胞で同定されている。さらに、ER -αは核にし、ラットの脳底動脈5の細胞質に位置しています。受容体が豊富で鮮やかな蛍光を発するが、受容体の個別のグループの明確な可視化が困難な可能性軟膜血管セグメントの多くの細胞層にある数字によるものです。さらに、免疫組織化学的手法を用いて多くの報告が不十分な共焦点顕微鏡詳細実験6の再現のための重要な要件とペア。この記事の私達の目的は、tを最適化するために単純な手法を説明することです彼は、染色とER -αの可視化雌ラットの脳から取得軟膜細動脈の断面スライスを使用して。まず、簡単に我々は解剖顕微鏡下で分離面軟膜動脈を識別するために、エバンスブルー色素のラットを灌流。動脈の8μmの断面をスライスするクライオスタットの使用は、その別の船の面がより明確に可視化するので、私たちは、薄い血管のセクションを取得することができます。容器を横断するのではなく、小血管のセグメントを使用すると内皮細胞と平滑筋層の見易さの利点があります。さらに、奥行きを拡張したソフトウェアとデジタル免疫蛍光顕微鏡の使用は10〜12種類の容器の平面の鮮明な画像を生成し、共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用するよりも低コストです。

この記事の目的は、デジタル免疫蛍光顕微鏡を用いたラットの軟膜動脈のスライスにエストロゲン受容体α（ERα）​​の免疫蛍光検出を最適化する方法を示すことです。

血管反応性に対するエストロゲンの作用の多くは、エストロゲン受容体1、2、3との相互作用を介して伝達されます。2つのサブタイプが存在しますが（エストロゲン…

この手順の目的は、雌ラットの脳から採取した皮質動脈の横断切片を用いて、エストロゲン受容体αの染色と可視化を最適化するための簡便な手法を説明することです。まず、脳表面からEvans blueで染色された皮質動脈を取り除き、セクショニング後にクライオスタットを用いて厚さ8 µmのリング状に切断します。得られた横断切片をスライドガラスに固定し、エストロゲン受容体αに対する一次抗体でインキュベートします。次に、切片を二次抗体および対比染色剤とともに、dpiを含む封入剤を用いてインキュベートします。最後に、蛍光標識された皮層血管セグメントを撮影し、拡張焦点深度（Extended Depth Focus）ソフトウェアを用いて2D画像に変換します。最終的に、拡張深度ソフトウェアを搭載したNikon免疫蛍光顕微鏡を使用することで、皮層細動脈のエストロゲン受容体アルファを示す結果を得ることができます。私はMarguerite Littleton Kearney博士です。本日は、私の研究室のポストドクターであるNeil Farani博士が、estrogen receptor alphaの可視化と染色の最適化のための簡便な手順を実演します。対象はpeelです。Evans blue染料で灌流し、-70 °Cで保存したラット脳の動脈を採取します。解剖顕微鏡を用いて、脳表面の皮質動脈を特定し、微細先端ピンセットで取り除きます。その際、付着している脳組織を注意深く取り除いてください。動脈を小さな試験管に入れ、氷上に置きます。0.1 MのPBSに含まれる2%冷ホルムアルデヒド溶液中で、動脈を30分間固定します。切片作成の準備として、-20 °Cに設定した凍結ディスク上に包埋剤を注ぎます。動脈の切片をチャックの上に平らに置き、凍結するまで待ちます。しっかりと凍結したら、クライオスタットの凍結ディスク上の包埋剤の中に、動脈を垂直に配置します。このとき、動脈の先端が前方に向いていることを確認してください。動脈が完全に凍結するまでピンセットで保持します。動脈を載せた凍結ディスクをクリオスタットのヘッドにセットし、8 µmの厚さの動脈リングをスライドガラス上に直接切片として切り出します。切り出した動脈切片をクロムカリウムゼラチンにマウントします。2本の筆を使用して動脈リングを真っ直ぐに整え、スライドを固定します。準備したスライドをスライドボックスに入れ、4 °Cの冷蔵庫で一晩保存します。スライドを冷蔵庫から取り出し、ベンチトップ上で室温に戻します。スライドを1〜1.5 mLの0.1 M PBSで洗浄します。10分後、PBSを排出し、この操作をさらに2回繰り返します。最後のPBS洗浄後、スライドを1 mLの50 mM塩化アンモニウム中で室温で30分間インキュベートします。内因性蛍光を低減させるため、前述と同様に0.1 M PBSで1回10分間として3回スライドを洗浄します。次に、一次抗体の非特異的結合を抑制するため、0.1% Triton X 100および1%正常ヤギ血清を含むPBS溶液中でスライドを30分間ブロッキングします。ブロッキング後、ブロッキング溶液で1:500に希釈したER alpha抗一次抗体をスライドに滴下し、4°Cで一晩インキュベートします。スライドを冷蔵庫から取り出し、室温に戻します。1〜1.5 mLの0.1% PBSで3回、各10分間洗浄し、未結合の一次抗体を除去します。各回、スライドをOregon Green, 4 88二次抗ウサギ抗体に含むブロッキング液で、室温・暗所にて2時間インキュベートします。インキュベーション後、0.1 M PBSで1回10分間、計3回スライドを洗浄し、その後、換気付きフードへ移動させます。封入剤（DAPI含有）を試料に1滴滴下し、カバーガラスを被せます。カバーガラスの縁に透明なネイルポリッシュを塗布して封印し、完全に乾燥させます。染色した維管束切片を載せた調製済みのスライドを顕微鏡にセットし、蛍光標識された目的領域が見えるように調整します。染色されたER alphaの可視化は、本手順の中で最も困難なステップです。受容体が最も明瞭に観察できる維管束の切断面を探してください。100倍の倍率で開始し、その後600倍まで倍率を上げます。カメラを使用して、細胞核に対するDPIチャンネルおよびDR alphaに対するZIチャンネルで画像をキャプチャし、ソフトウェアを用いて血管セグメントの複数の視野を2D画像に変換します。ここでは、ER alphaの免疫蛍光染色の結果を緑色で、DPIによる対比染色の結果を示しています。雌ラットの脳から単離した剥離動脈リングにおいて、青色で示されたマージ画像は、核内にエストロゲン受容体αが存在することを示唆しています。Zスタック画像を組み合わせることで、ERα免疫蛍光のフォーカス画像を obtain できます。一次抗体および二次抗体の両方について、自家蛍光陰性対照を用いて検証を行う必要があります。二次抗体でインキュベートしていない動脈の内皮側に沿って、明確な自家蛍光が認められることに注意してください。このビデオを視聴することで、脳表面から動脈を単離・剥離し、8 µmの横断輪を調製する方法について理解を深めることができます。さらに、蛍光標識したestrogen receptor alphaについて、また、デジタル免疫蛍光顕微鏡とNikonの拡張ソフトウェアを用いて受容体を可視化する方法について習得することができます。

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本稿では、電気生理学的、カルシウム...

Ex Vivo細胞生理学研究のため網膜細動脈の隔離

ここでは、マウス大様の内皮細胞を直接観察する免疫蛍光染色のためのプロトコルを提示する。この技術は、異なる流れパターンでの内皮細胞の細胞および分子表現型を研究し、アテローム性動脈硬化症の発症に有用である。...

血管内皮細胞を直接観察するためにエンフェイス免疫蛍光染色を用いて

このプロトコルは、クローン病の完全に検証されたTNBS誘導マウスモデルと、パラフィンに埋め込まれたホルマリン固定結腸切片の免疫蛍光を用いた免疫体化学によるエストロゲン受容体の視覚化方法を提示する。...

免疫蛍光を用いたTNBS誘発クローン病を用いたマウスの結腸におけるエストロゲン受容体の可視化

脳実質細動脈からの無傷のマウス脳内皮「チューブ」の集中的な調製は、脳血流調節を研究するために例示される。さらに、我々は、細胞内[Ca2+]および膜電位の変化を含む重要な細胞シグナル伝達経路の蛍光イメージングおよび電気生理学的測定のためのこの内皮研究モデルの実験的強みを実証する。...

マウス脳実質の動脈内皮の単離と機能解析

顕微鏡光学系をクリーンに保ち、高品質なイメージングのために重要です。ほこり、指紋、余分な液浸油、または上または顕微鏡で培地を取り付けるには、コントラストと解像度の低下を引き起こします。...

顕微鏡の適切な手入れとクリーニング

学ぶデジタル免疫蛍光顕微鏡法によるラット軟膜細動脈におけるエストロゲン受容体-αの可視化技術。低温切片機と抗体染色を用いて、神経血管研究におけるタンパク質局在解析の精度を向上させる再現性の高い手法です。

デジタル免疫蛍光顕微鏡を用いたラット軟膜細動脈におけるエストロゲン受容体-αのイメージング

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