デジタル免疫蛍光顕微鏡を用いたラット軟膜細動脈におけるエストロゲン受容体-αのイメージング

本手順の全般的な目的は、雌ラット脳から採取した皮質動脈の横断面スライスを用いて、エストロゲン受容体αの染色と可視化を最適化するための簡便な手法を説明することです。具体的には、まず脳表面からエバンズブルーで染色された皮質動脈を除去し、切片作成後、クライオスタットを用いてそれらを8 µmのリング状に切断します。得られた横断面をスライドガラスに封入し、エストロゲン受容体αに対する一次抗体でインキュベートします。

次に、dpiを含む封入剤を用いて、切片を二次抗体および対比染色液とともにインキュベートします。最後に、蛍光標識された皮層血管分節を撮影し、拡張焦点深度（extended depth focus）ソフトウェアを用いて2D画像に変換します。最終的に、拡張深度ソフトウェアを備えたNikon免疫蛍光顕微鏡を用いることで、皮層細動脈のエストロゲン受容体αを示す結果を得ることができます。

私はマーガレット・リトルトン・カーニー博士です。本日は、私の研究室のポストドクトラルフェローであるニール・ファラニ博士が、卵管皮膜におけるエストロゲン受容体αの可視化と染色の最適化のための簡便な手順を実演します。

Evans blue染料で灌流し、-70 °Cで保存したラット脳から動脈を採取します。解剖顕微鏡を用いて、脳表面にある皮質動脈を特定し、先みのピンセットで取り除きます。その際、付着している脳組織を慎重に取り除いてください。

動脈を小さな試験管に入れ、氷上に置きます。0.1 MのPBSで希釈した2%冷パラホルムアルデヒドを用いて、動脈を30分間固定します。切片作成の準備として、-20 °Cに設定したフリージングディスク上に包埋剤を注ぎます。

動脈の一節をチャックの上に平らに置き、凍結するまで待ちます。しっかりと凍結したら、クライオスタットの凍結ディスク上の包埋剤の中に、動脈を垂直に配置します。このとき、動脈の先端が前を向いていることを確認してください。

動脈が完全に凍結するまでピンセットで保持します。動脈を載せた凍結ディスクをクライオスタットのヘッドにセットし、厚さ8µmの動脈輪の薄切片をスライドガラス上に直接切り出します。切出した動脈切片をクロムカリウムゼラチンで封入します。

2本の筆を用いて動脈環をまっすぐに整え、スライドを乾燥させます。準備したスライドをスライドボックスに入れ、冷蔵庫（4 °C）で一晩保存します。スライドを冷蔵庫から取り出し、ベンチトップで室温に戻します。

スライドを1〜1.5 mLの0.1 M PBSで洗浄します。10分後、PBSを除去し、この操作をさらに2回繰り返します。最後のPBS洗浄後、スライドを1 mLの50 mM塩化アンモニウム中で室温で30分間インキュベートします。内因性蛍光を低減させるため、前述の方法に従い、0.1 M PBSで1回10分間、計3回スライドを洗浄します。次に、一次抗体の非特異的結合を抑制するため、0.1% Triton X 100および1%正常ヤギ血清を含むPBS溶液中でスライドを30分間ブロッキングします。

ブロッキング後、ブロッキング液で1:500に希釈したER alphaに対する一次抗体をスライドに滴下し、4°Cで一晩インキュベートします。スライドを冷蔵庫から取り出し、室温に戻します。結合していない一次抗体を、1〜1.5 mLの0.1% PBSで10分間、3回洗浄して除去します。

毎回、インキュベーション後、スライドをブロッキング液中のOregon Green, 4 88二次抗ウサギ抗体で室温・暗所で2時間インキュベートし、0.1 molar PBSで1回10分間、計3回洗浄した後、換気フードへ移動させます。DAPIを含む封入剤を試料の上に1滴滴下し、カバーガラスを被せます。カバーガラスの縁にクリアネイルポリッシュを塗布して密封し、完全に乾燥させます。

染色した維管束切片を載せた準備済みのスライドを顕微鏡にセットし、蛍光ラベルされた目的領域が見えるように調整します。染色されたER alphaの可視化は、本手順において最も困難なステップです。受容体が最も鮮明に観察できる維管束の切断レベルを探してください。

100倍の倍率から開始し、その後600倍まで倍率を上げます。カメラを使用して、細胞核に対するDPIチャネルおよびDR alphaに対するZIチャネルで画像を撮影し、ソフトウェアを用いて血管セグメントの複数の視点を2D画像に変換します。ここでは、ER alphaの免疫蛍光染色の結果を緑色で、DPIによる対比染色を合わせて示しています。

雌ラットの脳から単離した剥離動脈リングにおいて、マージ画像は核内にエストロゲン受容体αが存在することを示唆しています。Zスタック画像を組み合わせることで、ERα免疫蛍光のフォーカス画像を得ることができます。一次抗体および二次抗体の両方について、自家蛍光ネガティブコントロールを実施する必要があります。二次抗体でインキュベートしていない動脈の内皮側に沿って、明瞭な自家蛍光が見られることに注意してください。

このビデオを視聴することで、脳表面から動脈を分離および剥離し、厚さ8 µmの横断切片リングを調製する方法を習得することができます。さらに、蛍光標識されたエストロゲン受容体αについて理解し、デジタル免疫蛍光顕微鏡とNikonの拡張ソフトウェアを用いて受容体を可視化する方法を習得することが期待されます。