マウスモデルにおける網膜色素上皮へのウイルスベクターの網膜下注射

麻酔をかけたマウスから始めて、瞳孔拡張剤を塗布します。

顕微鏡下でまぶたを開き、目を少し突き出して注射部位を露出させます。

眼科用粘弾性溶液を一滴塗布し、カバーガラスを置き、網膜を視覚化します。

細い針を使用して、角膜と強膜の接合部の後ろに穴を開け、血管や水晶体への損傷を防ぎます。

この事前に穴が開いた穴から、網膜ニューロンを支える網膜色素上皮またはRPE近くの網膜下腔に鈍い注射器を接線方向に挿入します。

標的遺伝子を運ぶレンチウイルスベクターを網膜下腔に注入します。

体液の蓄積による網膜下水疱の形成を観察し、ベクター送達の成功を確認します。

まぶたをそっと閉じて注射部位を覆い、マウスが回復するまで待ちます。

レンチウイルスはエンドサイトーシスを介してRPEに入り、その遺伝物質を放出し、対応するDNAに変換し、宿主ゲノムと統合して遺伝子発現を可能にします。

まず、33ゲージの鈍い針が付いたマイクロリットルの注射器を用意します。エチレンオキシドガスで滅菌します。次に、マイクロフュージチューブ内のPBS中のウイルスベクターの希釈液を、マイクロフュージチューブで約100万力価単位/マイクロリットルで調製します。ここで、シリンジを装填するときは、溶液で数回洗い流して、シリンジ内のデッドスペースを取り除きます。注入する準備を整えて1.5〜2マイクロリットルを用意します。

ウイルスベクター注射を準備した状態で、ティレタミン、ゾラゼパム、キシラジンの腹腔内注射で成体マウスを麻酔します。反射神経がないため、動物が麻酔をかけられていることを確認します。麻酔が確認されたら、0.5%のフェニレフリンと0.5%のトロピカミドを滴下して瞳孔を拡張します。次に、手術用顕微鏡下でまぶたを開き、目を突き出して赤道を露出させます。指を眼窩縁の外側に置いて、この位置に目を保持します。

次に、眼科用粘弾性溶液を角膜表面に塗布し、角膜の上に小さな丸いカバースライドを置きます。したがって、網膜を見ることができます。次に、輪部の少し後方、右目の下、または左目の上側に、滅菌済みの30ゲージのハーフ針を使用して小さな穴を開けます。一時的に配置された穴や鼻に配置された穴は、カバーするのが難しいため、良い選択ではありません。

穿

刺中は輪部血管やレンズに当たらず、針のベベル全体を挿入しないでください。

網膜下注射の場合は、ベクトル注射針を虹彩面に対して45度の角度で穴に挿入します。針を乳頭周囲領域に向かって後方に押し、示された経路に従って硝子体腔を横切ります。RPE層に到達したことを示す軽度の抵抗が感じられるまで、網膜下腔に針を近づけます。

針は潜在的な網膜下腔に配置する必要があるため、過度の圧力で強膜組織を貫通しないでください。針が過度の力で頭蓋骨組織に穴を開けると、抵抗なく外眼窩腔に入ります。

次に、ウイルスベクターを網膜下腔にそっと注入します。非常に重要な組織の損傷を防ぐために、針を非常に静止させてください。次に、針を同じようにそっと引き抜きます。これで、眼球を解放できます。ベクターの蓄積を示す網膜下の水疱が見えるはずです。最後に、まぶたをそっと閉じて注射部位を覆います。穴のセルフシールが発生します。