マウス皮質介在ニューロン前駆細胞におけるアガロース包埋エレクトロポレーション支援遺伝子導入

目的の遺伝子を運ぶプラスミドベクターと追跡色素を含むDNA混合物をマイクロピペットに充填します。マイクロマニピュレーターで固定します。

アガロースブロックを顕微鏡下に置き、その上に皮質介在ニューロンを備えたアガロース包埋マウス胚脳スライスを置きます。

マイクロピペットを下げ、DNA混合物を介在ニューロン前駆細胞領域に注入します。追跡色素は注射部位をマークします。

別のアガロースブロックをペトリ皿電極上に配置し、アガロースカラムをカバー電極上に配置します。

スライスをブロックに移し、カバー電極を注射部位に合わせます。

短い電気パルスを印加して細胞膜を一時的に透過処理し、プラスミドが核に入るようにします。

細胞生存率を維持するために、スライスを培地でインキュベートします。

核内では、プラスミドが遺伝子発現を引き起こし、標的タンパク質を産生し、介在ニューロン前駆細胞の機能を調節します。

注射では、各ベクターの発現ベクターDNAとコントロールベクターDNAを1マイクロリットルあたり1マイクログラムの濃度で混合し、1〜10回希釈で高速グリーンストック溶液を加えます。引っ張った内径0.5ミリメートル、外径1ミリメートルのガラスマイクロピペットに10マイクロリットルのDNA混合物を充填し、マイクロピペットを空気圧ピコポンプインジェクターにロードします。アガロースの大きなブロックを実体顕微鏡下に置き、注入するスライスをアガロースの断片に置きます。

次に、25〜50ナノリットルの容量を、スライスの選択された内側神経節または尾側神経節隆起領域に注入します。注入直後に、小さなアガロースブロックをペトリ皿電極に置き、平らな端のマイクロスパチュラを使用してアガロースカラムをモバイルカバー電極に取り付けます。

注入されたスライスを支持膜とともにアガロースブロックに移し、アガロースカラムを備えた上部電極をスライスの選択領域の上に置きます。次に、500ミリ秒間隔で125ボルトの5ミリ秒パルスを2つ電気めっきします。エレクトロポレーション後、支持膜のあるスライスを保持皿に戻し、皿を組織培養インキュベーターに戻します。