0 閲覧数 • 3:00 分 • June 17th, 2025
化学的に固定されたマウスの脳スライスをマルチウェルプレートに取ります。
組織には、脂質が豊富なミエリン鞘に囲まれた軸索が含まれています。細胞体には、粗い小胞体とリボソームで構成されるニッスル体が含まれています。
蛍光ニッスル染色を含む透過処理溶液でインキュベートします。この溶液は細胞膜を透過性化し、染色剤がニッスル体内のリボソームRNAに結合し、細胞体に標識することができます。
コヒーレント反ストークスラマン分光法(CARS)イメージングシステムを備えた共焦点顕微鏡下に組織を置きます。
組織に直接同期されたポンプとストークスレーザービームを組織に照射し、脂質が豊富なミエリン鞘の分子結合を励起するように調整します。
プローブレーザービームを導入して励起された結合と相互作用し、ミエリンに特異的な抗ストークス信号を生成します。
光検出器は信号をキャプチャして、ミエリン特異的画像を生成します。
共焦点イメージングを使用して、標識されたニッスル体からのシグナルをキャプチャします。
ニューロンの構造を視覚化するために、共焦点画像とCARS画像を重ね合わせます。
原稿に記載されているように組織を準備した後、Nisslおよび抗体培地のフリーフローティング切片を染色して、細胞体を視覚化します。次に、切片を標準的な実験室用シェーカーで室温で30分間インキュベートします。サンプルを顕微鏡に持っていく前に、CARSレーザーの電源を入れ、少なくとも1時間暖めます。次に、ポンプ レーザー ビームとストークス レーザー ビームを空間的に重ねて CARS レーザーを位置合わせし、2 つのレーザー ビーム間の遅延を調整します。
Kohlerは、前方CARSイメージング用の顕微鏡のコンデンサー光学系と絞りです。次に、外部潜望鏡を調整して、空間的に重なり合った2つのレーザーを顕微鏡の走査ヘッドミラーの中央に配置します。フォワードCARS非デスキャン検出を最適に行うには、コンデンサーがコラー化されていることを確認してください。
免疫蛍光共焦点イメージングおよびCARSイメージングの場合、蛍光イメージング用の可視レーザーを備えた共焦点顕微鏡を組み込むことにより、CARSレーザーをフォワードおよびエピCARS非デスキャン検出器の両方に適合させます。次に、組織の乾燥を避けるために、カバーガラスの底とPBSを備えた培養皿に切片を置きます。また、ガラスの重りを使用して、組織をカバーガラスの近くに保ちます。
グラフィックユーザーインターフェイスの使用。CARSおよびNissl蛍光共焦点イメージングの画像取得パラメータを設定します。サンプルを顕微鏡ステージに置きます。サンプルに焦点を合わせ、画像をキャプチャします。