ネガティブステインEMによるタンパク質と高分子複合体の可視化：グリッドの準備から画像取り込みに

この手順の全体的な目的は、ネガティブ染色電子顕微鏡法を用いて精製タンパク質試料を可視化することです。まず、試料を支持するための電子顕微鏡用グリッドを準備します。次に、ネガティブ染色液を調製します。

次に、試料を電子顕微鏡用グリッド上に滴下し、ネガティブ染色を行います。最後に、EMグリッドを電子顕微鏡に装填し、適切な光学条件下で画像を記録します。従来の明視野DEM画像は高コントラストで細部まで鮮明であり、特徴のない背景に単一の巨大分子が散在している様子が示されます。

ネガティブ染色電子顕微鏡法は、目的のタンパク質を可視化するための簡便な手法です。精製したタンパク質の構造解析や、その他の生化学的・生物物理学的アッセイにおいて、ルーチン的な分析法として利用可能です。本稿では、電子顕微鏡観察のためのネガティブ染色サンプルの調製方法について解説します。

いくつかの手順はテキストの説明や図からは習得しにくいため、本手法を視覚的に実演することが有用です。まず、ガラスピペットを用いて、大きなビーカーに入った水面の表面にコロジオンを1滴落とします。コロジオンが広がる際、水面の塵を取り込むことがあります。

埃が付着したコロジオンプラスチックのフィルムを取り除き、別の液滴に置き換えます。次に、50枚から100枚のEMグリッドを1枚ずつ、光沢面を下にして浮いているプラスチックフィルムの上に配置します。日常的なネガティブ染色には400メッシュのグリッドを選択し、200メッシュのグリッドも選択してください。

チルトペア画像を収集する場合。グリッドの面積よりわずかに大きい、シワのない吸収性の低い紙を用意します。その紙をグリッドの上に置き、紙が完全に濡れるまで待ちます。

紙が水を吸収しすぎないようにする必要があります。ここでは、安価なメモ帳の紙を使用します。これで、グリッドがプラスチックフィルムと紙に挟まれた状態になります。

ピンセットを使用して、ペーパーをペトリ皿に入れ、ゆっくりと自然乾燥させます。しわの原因となるため、より速い乾燥方法は避けてください。当研究室で使用しているカーボンコーターは、Creston 2 0 8 C 高真空ターボカーボンコーターです。

Creston膜厚モニターを装備しています。このモニターはカーボン堆積に感度を持つ水晶振動子天秤を利用しています。しかし、本プロトコルではこの装置は必要ありません。まず、カーボンコーティング装置でカーボンロッドを研磨し、装着します。

次に、フロスト領域の半分を未塗装にするため、真空グリスを塗布したガラススライドを被覆します。カーボンコーティング後、スライドのグリス塗布領域を用いてカーボン層の厚さを推定します。カーボンコーティング機のベルジャー内ステージに、グリッドを貼った紙を置きます。グリスを塗布したガラスを配置します。

グリッドの横にスライドさせます。真空チャンバーを少なくとも 10 micro tours まで排気してください。そうしないと、スパークによってグリッドに多くの大きな粒子が発生します。その後、電流を非常にゆっくりと上げてください。

カーボンロッドの鋭い先端は極めて明るくなります。コーティング開始時に肉眼で観察しないでください。カーボンコートが蓄積されるにつれて、ガラススライドの色は濃い灰色に変化します。目的のカーボン膜厚に達したところで電流を遮断してください。その際、ベルジャーの透過度を考慮してください。この判断において、スライドの暗さがカーボン膜厚に対して校正されていれば、本手法はより高価な膜厚モニターと同等の精度を持ちます。

プロセスが完了したら、真空チャンバーをベントし、コーティング済みグリッドを取り出して後で使用します。薄いプラスチック層はネガティブ染色像の品質に影響しませんが、手続きを進める前に、グリッドをクロロホルムに数時間浸すことで除去できます。新鮮な L-formate 溶液を調製するか、暗所で2週間未満保存された溶液を使用してください。

適切に調製された新鮮な溶液は黄色を呈し、pHは約4であり、沈殿物なく非常にクリアな状態です。まず、市販のグロー放電装置を用いて、カーボンコートグリッドのグロー放電処理を行ってください。

次に、蒸留水を 20 µL ずつ2滴、および新鮮な尿酸ホルム酸溶液を 25 µL ずつ2滴、パラフィルムの上に滴下します。逆向きの力を持つアンチキャピラリーピンセットを用いて、グロー放電処理したグリッドをカーボンコート面を上にして保持します。重要な点として、これらのピンセットはグリッドから液体を吸い上げることがありません。

次に、2 µLのタンパク質試料をグリッドに滴下し、タンパク質がグリッドに吸収されるまで待ちます。通常は30秒かかりますが、極めて低濃度の試料ではより長い時間を要する場合があり、それがバッファー濃度に影響を与える可能性があります。完了後、フィルターペーパーを使用してタンパク質試料を吸い取ります。

次に、グリッドの表面を水滴に軽く触れさせ、数秒以内に吸い取って乾かす操作を2回繰り返し、グリッドを洗浄します。その後、グリッドを染色液の滴に軽く触れさせ、すぐに吸い取って乾かします。同様の手法を用いて、グリッドを2回目の染色液の滴に20秒間接触させます。

最後に、ベンチ型ドラフトチャンバー内、あるいは可能であればEMセッション前に真空中でグリッドを風乾させます。EM顕微鏡のアライメントを確認し、最適化されたアライメントファイルがある場合はそれをロードしてください。これにより、ほぼ完璧な状態に復元されます。次に、EMグリッドをシングルチルト標準試料ホルダーに装着します。その後、ホルダーをステージに挿入してください。

次に、ポンピングサイクルが完了するまで待ち、ホルダーをカラムに挿入します。ここで、染色の良好なサンプル領域の探索を開始します。最小コントラスト法を用いるか、またはCC、Dカメラを使用してライブフォーカスを計算し、手動でフォーカスを合わせます。

パワースペクトルを確認します。次に、必要に応じてディープフォーカスを設定します。通常は-1.5 µmに設定します。グリッド全体で染色の濃度が異なる場合があるため、白いコントラストを持つタンパク質を探してください。

染色のムラがある領域や、タンパク質のコントラストが黒くなる陽性染色の領域は避けてください。グリッドの作成およびネガティブ染色サンプルの可視化には、概説した手法を用いました。デモンストレーション目的で、いくつかの既知のタンパク質のイメージングを行いました。

詳細な構造と鮮明なコントラストに注目してください。このビデオを視聴することで、電子顕微鏡で観察するための、ネガティブ染色した高分子サンプルの作製方法を十分に理解できるはずです。この手法を習得すれば、約4時間で完了させることができます。

この手順に続き、分子構造をより詳細に理解するために、3D再構成などの他の手法を行うことができます。