ネガティブステインEMによるタンパク質と高分子複合体の可視化：グリッドの準備から画像取り込みに
December 22nd, 2011
負染色電子顕微鏡（EM）で視覚化するタンパク質サンプルは、ポピュラーな構造解析の方法となっている。それは、タンパク質製剤の品質の定性試験のためにもそのような研究されている分子の三次元再構成を計算すると、定量的な構造解析に有用である、と。この記事では、EMグリッドを準備する試料を染色し、電子顕微鏡で試料を可視化するための詳細なプロトコールを提示する。初心者ユーザーは、簡単にこれらのプロトコルに従うことができますし、それらのタンパク質サンプルを評価するため、他の生化学的アッセイに加えて、ルーチン分析としてEMを染色陰性活用する。
この手順の全体的な目標は、ネガティブステイン電子顕微鏡によって精製されたタンパク質サンプルを視覚化することです。これは、まずサンプルを支える電子顕微鏡グリッドを準備することによって達成されます。手順の2番目のステップは、陰性染色液を準備することです。
次に、サンプルを電子顕微鏡グリッドに塗布し、ネガティブ染色します。最後に、EMグリッドを電子顕微鏡にロードし、適切な光学条件下で画像を記録します。従来の明視野であるDEM画像は、コントラストが高く、鮮明で詳細であり、特徴のない背景に散らばった単一の高分子を示しています。
ネガティブステイン電子顕微鏡は、お気に入りのタンパク質を視覚化する簡単な方法です。精製したタンパク質を検査するためのルーチンアッセイとして、構造解析やその他の生化学的および生物物理学的アッセイに使用できます。ここでは、電子顕微鏡用のネガティブ染色サンプルの調製方法を示します。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、テキストの説明や図から学ぶのが難しい手順があるため、役立ちます。まず、ガラスピペットを使用して、コロジオンを1滴、水面の大きなビーカーに水を入れます。コロジオンが広がると、水面から粉塵を捕らえることがあります。
コロジオンプラスチックのほこりっぽいフィルムを取り外して、別の滴と交換します。次に、50〜100個のEMグリッドを1つずつ、光沢のある面を下にして浮かぶプラスチックフィルムに配置します。ルーチンのネガティブ染色には400メッシュのグリッドを選択し、200メッシュのグリッドを選択します。
チルトペアの画像を収集します。グリッドの領域よりわずかに大きい、しわのない緩やかな吸収性の紙を選択します。グリッドの上に用紙を置き、用紙が完全に濡れるまで待ちます。
紙は水を吸収しすぎてはいけません。安いメモ帳の紙を使用しています。これで、グリッドがプラスチックフィルムと紙の間に挟まれました。
鉗子を使用して紙をペトリ皿に入れ、ゆっくりと風乾します。より速い乾燥方法は、しわにつながる可能性があるため、避けてください。当研究室で使用しているカーボンコーティング機は、クレストン2 0 8 Cの高真空ターボカーボンコーティング機です。
クレストン膜厚モニターを装備。モニターは、炭素堆積物に敏感なクォーツ天びんを利用しています。ただし、ここで説明するプロトコルは、このデバイスを必要としませんカーボンコーティングマシンでカーボンロッドを研ぎ、ロードすることから始めます。
次に、つや消し領域の半分をコーティングせずに真空グリースを塗布したスライドガラス カーボンコーティング後、スライドのグリースを塗った領域を使用して、カーボンコーティングの厚さを推定します。グリッド付きの紙をカーボンコーティング機のベルジャーの下のステージに置きます。グリースを塗ったグラスを配置します。
グリッドの横をスライドします。真空チャンバーを少なくとも10マイクロツアーまでポンプで送らないと、火花がグリッドに多くの大きな粒子を生成します。次に、電流を非常にゆっくりと増加させます。
カーボンロッドの尖った先端は非常に明るくなります。コーティングが始まると、カーボンコートが蓄積するとスライドガラスの色が濃い灰色に変わり、目的のカーボンの厚さで電流をカットし、ベルジャーの透明度を考慮に入れて、肉眼で観察しないでください。この判断を下すとき、スライドの暗さがカーボンの厚さに較正されると、この方法はより高価な膜厚モニターと同じくらい正確になります。
プロセスが終了したら、真空チャンバーをベントし、コーティングされたグリッドを取り外して後で使用できます。薄いプラスチック層は、ネガティブに染色された画像の品質に影響を与えませんが、グリッドをクロロホルムに数時間浸すことで除去できます。新鮮な尿Lギ酸溶液を作るか、2週間未満暗所で保存した溶液を使用してください。
良質な新鮮な溶液は黄色で、pHは約4で、沈殿物がなく非常にきれいに動作します。まず、市販のシステムを使用して光らせます。カーボンコーティングされたグリッドを排出します。
次に、20マイクロリットルの蒸留水2滴と2つの25マイクロリットルの新鮮なギ酸溶液をパーフィルに注ぎます。逆力の反毛細管鉗子を使用して、カーボン上塗を施してあるカーボン ペーパーを上にして、輝きを排出した格子を握る。重要なことに、これらの鉗子はグリッドから液体を吸い上げません。
次に、2マイクロリットルのタンパク質サンプルをグリッドに適用し、タンパク質がグリッドに吸収されるのを待ちます。通常、これには30秒かかりますが、非常に希薄なサンプルではさらに時間がかかり、バッファーの濃度に影響を与える可能性があります。終了したら、濾紙を使用してタンパク質サンプルを拭き取ります。
次に、グリッドの表面に短時間触れて水滴に触れ、数秒以内に吸い取りして乾かして、グリッドを2回洗います。水が汚れの滴にグリッドに短時間触れた後、すぐにそれを拭き取り乾かします。同じ手法を使用して、グリッドを2番目の汚れの滴に20秒間接触させます。
最後に、ベンチのヒュームフードのグリッドを風乾するか、できればEMセッションの前に真空中で、EM顕微鏡のアライメントを確認し、可能な場合は完成したアライメントファイルをロードして、ほぼ完璧な状態に復元する必要があります。次に、EMグリッドをシングルチルト標準試料ホルダーにロードします。次に、ホルダーをステージに挿入します。
次に、ポンピングサイクルが完了するのを待ち、ホルダーをカラムに挿入します。次に、汚れの良いサンプル領域の検索を開始します。最小コントラスト法を使用するか、CC、Dカメラを使用してライブ4を計算することにより、手動でピントを合わせます。
あなたのパワースペクトル。次に、必要に応じてディープフォーカスを(通常はマイナス1.5ミクロン)に設定します。染色濃度はグリッド全体で異なる可能性があるため、コントラストが白いタンパク質を探してください。
汚れが不均一であったり、タンパク質のコントラストが黒くなるような陽性の汚れのある領域は避けてください。概説されたアプローチを使用して、グリッドを作成し、ネガティブに染色されたサンプルを視覚化します。いくつかの身近なタンパク質をデモンストレーション目的で画像化しました。
そのディテールとシャープなコントラストに注目してください。このビデオを見れば、電子顕微鏡で観察するためのネガティブ染色された高分子のサンプルを生成する方法について十分に理解できるはずです。一度マスターすれば、このテクニックは約4時間で実行できます。
この手順に続いて、分子構造をよりよく理解するために、3D再構成などの他の方法を実行できます。
概要
この記事では、ネガティブステイン電子顕微鏡法（EM）を用いた精製タンパク質サンプルの可視化のための詳細なプロトコルを紹介します。この方法は初心者にも利用可能で、タンパク質の構造解析のための日常的なアッセイとして機能します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 構造生物学
- 電子顕微鏡法
- タンパク質分析
背景
- ネガティブステインEMはタンパク質の可視化に広く使用されている技術です。
- 定性的および定量的な構造解析の両方に対応します。
- サンプルの準備と可視化のためのプロトコルは成功した適用に不可欠です。
- この方法はタンパク質構造の理解を深めることができます。
研究目的
- EMグリッドの準備とサンプルの染色のための包括的なガイドを提供すること。
- ネガティブステインEMを用いたタンパク質の可視化を実証すること。
- タンパク質分析におけるこの方法の日常的な使用を促進すること。
使用された方法
- 電子顕微鏡グリッドの準備。
- タンパク質サンプルへのネガティブステイン溶液の適用。
- 電子顕微鏡下でのサンプルの可視化。
- 最適な条件下での画像の記録。
主要な結果
- タンパク質の高いコントラスト画像が得られました。
- 詳細なプロトコルが成功裏に実証されました。
- 視覚的補助により複雑なステップの理解が深まりました。
- 結果はタンパク質の定常的解析のためのネガティブステインEMの使用を支持しています。
結論
- ネガティブステインEMはタンパク質の可視化に効果的な方法です。
- 提供されたプロトコルは初心者でも簡単に従うことができます。
- この技術は他の生化学的アッセイを補完することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Negative stain electron microscopy (EM) provides rapid, high-contrast visualization of purified proteins and macromolecular complexes, enabling early-stage assessment of sample quality and assembly state. This technique supports critical go/no-go decisions in discovery pipelines by confirming sample homogeneity and complex formation before resource-intensive downstream studies. Its accessibility and reproducibility make it a foundational tool for structural biology teams in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of protein complexes to confirm assembly and integrity.
- Supports rapid assessment of sample homogeneity, reducing ambiguity in target validation.
- Facilitates early detection of aggregation or degradation, de-risking downstream workflows.
- Provides visual evidence to support mechanistic hypotheses in target selection.
Screening & Assay Development
- Validates the quality of protein preparations prior to high-throughput screening or assay development.
- Ensures reproducibility and standardization of sample inputs for quantitative assays.
- Enables scalable preparation of validated EM grids for repeated use in screening campaigns.
- Supports reliable evaluation of compound effects on protein structure or assembly.
Translational & Preclinical Research
- Confirms structural integrity of therapeutic candidates prior to preclinical studies.
- Aligns visual data with biochemical and biophysical assays for translational continuity.
- Reduces risk of advancing structurally compromised candidates into preclinical models.
- Provides foundational data for subsequent 3D reconstruction and mechanistic studies.
Pipeline & Workflow Integration
Negative stain EM is positioned at the interface of protein purification and structural or functional characterization, bridging early discovery and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing protein complexes and assemblies.
- Screening: Confirms sample quality and reproducibility for downstream assays.
- Analytics: Provides high-contrast images for quantitative assessment of sample homogeneity and aggregation.
- Translational Research: Ensures structural fidelity of candidates entering preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, routine assay adaptable across diverse protein targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in sample quality and target validation.
- Operational Value: Delivers rapid, reproducible, and scalable visualization workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM grid preparation and instrument operation.
- Needs access to electron microscopy infrastructure and staining reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducible sample preparation and imaging.
- Adaptable to a wide range of protein sizes and complex types.
- Limited to surface visualization; not suitable for high-resolution internal structure analysis.
