0 閲覧数 • 5:18 分 • June 17th, 2025
灌流室に取り付けられた麻痺したトランスジェニックゼブラフィッシュの幼虫を取ります。
幼虫は、水の動きを検出する側線システムの構成要素であるニューロマストの有毛細胞で膜に局在するカルシウム指標を発現します。
有毛細胞は、先端の毛束と基底シナプス前領域で構成され、求心性ニューロンとシナプスを形成して信号を伝達します。
共焦点顕微鏡下で、低倍率を使用して流体ジェットピペットを幼虫の近くに配置します。
倍率を上げてニューロマストの位置を特定し、ピペットをその近くに再配置し、
蛍光イメージング
に切り替えます。液体パルスを送達して毛束をそらし、カルシウムイオンを含む頂端陽イオンの流入のための機械伝達チャネルを開きます。
弱い蛍光指示薬はカルシウムに結合し、局所的な蛍光の増加を引き起こします。
陽イオンの流入は細胞を脱分極させ、基底前シナプスの電位依存性チャネルを通るカルシウムの侵入を引き起こし、そこで指示薬に結合して局所的に蛍光を増加させます。
頂端および基礎カルシウムのダイナミクスをリアルタイムで視覚化します。
この手順では、ゲルローディングチップを使用して、適切に壊れた流体ジェット針に10マイクロリットルのニューロンバッファーをバックフィルします。溶液を気泡なしで先端に均等にロードします。次に、電動マイクロマニピュレーターに取り付けられたピペットホルダーに針を挿入します。
灌流チャンバーを顕微鏡ステージの円形チャンバーアダプターに入れます。幼虫が視野の中央になるように電動ステージを動かします。続いて、幼虫のA-P軸が流体ジェット針の軌道とほぼ揃うように円形チャンバーアダプターを回します。
透過光と微分干渉コントラストを使用して、幼虫に焦点を合わせ、10倍対物レンズの下に中央に配置します。次に、10倍の目標を上げます。電動マイクロマニピュレーターを使用して、流体ジェット針を視野の中心に下ろし、透過光に照らされ、ニューロンバッファーにほとんど触れないようにします。
10倍の対物レンズを下げて幼虫に焦点を合わせ、その位置を確認します。流体ジェット針に対物レンズを合わせます。マイクロマニピュレーターで流体ジェット針をx軸とy軸で動かし、幼虫の背側と平行な位置になります。
その後、幼虫に焦点を合わせます。針をz軸に下ろし、魚の背側に沿って体から1ミリ離して針を置きます。円形チャンバーアダプターを慎重に動かして、流体ジェット針が幼虫のAP正中線に沿って位置合わせされていることを確認します。
次に、60倍の水の対物レンズに切り替えます。対物レンズがニューロンバッファーに浸されていることを確認します。ファインフォーカスを使用してニューロマストを見つけます。続いて、電動ステージを動かして、目的のニューロマストを視野の中心に配置します。
流体ジェット針の先端を魚の背側に沿って保ちます。流体ジェット針の先端を幼虫やチャンバー表面に触れないでください。マイクロマニピュレーターで流体ジェット針を、ニューロマストの外縁から100マイクロメートルになるように配置します。
次に、頂端の毛束の先端に焦点を合わせます。流体ジェット針の底は、この平面に焦点が合っている必要があります。高速圧力クランプを手動モードから外部モードに設定し、イメージングソフトウェアからの入力を受け取ります。ゼロボタンを押して高速圧力クランプをゼロにし、セットポイントノブを使用して静止圧力をわずかにプラスに設定します。ヘッドステージ出力に取り付けられたPSI圧力計を使用して、高速圧力クランプの静止出力を確認します。
毛束を刺激するために必要な圧力を決定するには、0.125ボルトと0.25ボルトの出力で200〜500ミリ秒のテスト刺激を加えます。テスト刺激ごとに、毛束の先端(キノシリア)のたわみの距離を測定します。束を約5マイクロメートルの距離移動させる圧力を選択してください。キノシリアの先端がずっと焦点を合わせたままであることを確認してください。
単一平面画像を取得するには、フレーム30以降の80フレーム取得中に3秒間に配信する刺激を選択します。機械感受性カルシウム反応を測定するには、頂端毛束の基部に焦点を合わせ、画像取得を開始します。シナプス前カルシウム応答を測定するには、有毛細胞の基部に焦点を合わせ、画像取得を開始します。