共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部の特性評価

化学的に固定および透過処理されたマウス筋線維をマルチウェルプレートのウェルに入れることから始めます。

ブロッキング溶液でインキュベートして、非特異的抗体結合を最小限に抑えます。

神経筋接合部またはNMJで発現するシナプス前タンパク質を標的とする一次抗体を追加します。

バッファーで洗浄して、結合していない抗体を除去します。

一次抗体を標的とする蛍光色素結合二次抗体、およびシナプス後アセチルコリン受容体に結合する蛍光色素結合神経毒とインキュベートします。

バッファーで洗浄して、結合していない試薬を除去します。

取付材の入ったスライドにファイバーを置き、カバーガラスを配置し、円筒形の磁石で固定してファイバーを平らにします。

共焦点STED顕微鏡を使用してイメージングを開始します。

レーザー照射すると、標識されたタンパク質は蛍光を発します。

共焦点顕微鏡は、解像度が限られており、蛍光が広がるため、より微細なNMJ構造を鮮明に分解できません。

対照的に、STED 顕微鏡は空乏レーザーを使用して蛍光の拡散を抑制し、鮮明な NMJ の視覚化を可能にします。

安楽死後、2つの細い鋸歯状の鉗子を使用して、幅約1ミリメートルの小さな繊維束で前脛骨筋をからかい始めます。次に、これらの筋肉束をPBSで調製した1%Triton X-100を含む24ウェルプレートに移し、室温で1時間、または摂氏4度で5時間穏やかに撹拌します。

サンプルを室温でPBSで5分間3回洗浄した後、PBSで調製した4%BSAからなるブロッキング溶液と1%Triton X-100でサンプルを摂氏4度で穏やかに攪拌しながら4時間インキュベートします。次に、ニューロフィラメントMまたはシナプス小胞糖タンパク質2のいずれかに対する一次モノクローナル抗体を含む同じブロッキング溶液でサンプルを一晩インキュベートし、それぞれシナプス前軸索終末または活性ゾーンを標識します。

翌日、標識された筋肉束をPBSで5分間3回洗浄し、穏やかに攪拌します。次に、室温でシェーカーに2時間置いて、適切な二次抗体とインキュベートします。筋肉束を再度洗浄した後、封入剤を入れたスライドの上に置きます。次に、上部に 1.5 グレードのガラス製カバーガラスを置き、続いてスライドの両側に円筒形の磁石を置き、圧力を加えて筋肉を平らにします。

共焦点顕微鏡を使用して画像を取得するには、顕微鏡ソフトウェアを起動し、構成モードとしてマシンを選択し、テキスト原稿に記載されている設定に従って、各実験グループの神経筋接合部の画像スタックを収集します。セッションの最後に、[3Dビューアで開く]をクリックし、実験グループを代表する神経筋接合部を選択して、3Dラベリングを視覚化します。