アストロサイトにおけるコンパートメント特異的ダイナミクスのための自発的カルシウムイメージング

記録チャンバー内のニューロンと星状細胞の混合培養物を含むポリマーコーティングされたカバーガラスを取ります。

これらのトランスフェクトされた細胞は、形質膜および小胞体膜上にカルシウム感受性タンパク質を発現し、カルシウム結合時に蛍光を発して細胞内カルシウム動態を追跡します。

カルシウムイオンを含む培地を加え、蒸発を防ぐためにチャンバーを覆います。

チャンバーを蛍光顕微鏡下に置きます。

カルシウムイオンはカルシウム感受性タンパク質に結合します。青色光を照射すると、小胞体外膜のカルシウム感受性タンパク質が緑色に蛍光を発します。この緑色蛍光を使用して、星状細胞を特定します。

次に、緑色の光を照射します。原形質膜上のカルシウム感受性タンパク質は赤色に蛍光を発します。緑色の蛍光を示す同じ星状細胞に赤色蛍光が存在することを確認します。

原形質膜上のカルシウム感受性タンパク質のタイムラプス画像を記録し、続いて小胞体外膜上のカルシウム感受性タンパク質を記録します。

画像を分析して、選択した星状細胞におけるコンパートメント特異的な自発カルシウム活性を観察します。

Lck-RCaMP2およびOER-GCaMP6fでトランスフェクトされた細胞を含むカバーガラスを顕微鏡の記録チャンバーに取り付けます。400マイクロリットルのイメージングメディアを加え、チャンバーの上に蓋を置きます。GCaMP6fのフィルターセットと光源を選択します。OER-GCaMP6fを発現する星状細胞を見つけます。

次に、RCaMP2のフィルターセットと光源を選択します。そして、Lck-RCaMP2が同じ星状細胞で発現しているかどうかを確認します。Lck-RCaMP2のタイムラプス画像を2ヘルツで2分間記録し、画像データを保存します。

この後、フィルターセットをGCaMP6fのフィルターセットに戻します。OER-GCaMP6f のタイムラプス画像を 2 ヘルツで 2 分間記録します。次に、イメージングデータを保存します。