小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

次の実験の全体的な目標は、低分子誘導を使用して、多能性ヒト胚性幹細胞から直接かつ排他的にニューロンの子孫を導き出すことです。これは、定義された条件下で維持された未分化細胞にレッチノ酸を添加することによって達成されます。次に、細胞を浮遊培養液中で分離させ、神経芽細胞と呼ばれる浮遊細胞クラスターを形成することで、分化プロセスを継続します。

神経芽細胞が神経分化培地中の組織培養プレートに付着することが許されると、神経芽細胞は成熟ニューロンの特性を発達させます。最終的には、免疫蛍光法およびデコンボリューション顕微鏡または共焦点顕微鏡法を使用して、処理されたヒト胚性幹細胞の形態およびマーカー発現におけるレチノ酸処理の効果を示すことができます。他の技術では、細胞のごく一部のみがニューロンの表現型を追求するが、我々の方法は、小分子の単純な供給によって、ニューロン系統のみに向けた多能性ヒト胚性幹細胞の十分に制御された効率的な誘導を可能にする。

ストックソリューションを修理する際に注意すべきいくつかの手順があります。マトリゲルとヒトラミニンをマイナス80°Cから4°Cまでゆっくりと解凍するように注意し、メディアを摂氏4度で一晩保存し、使用前にメディアを必ず37°Cに温めてください。また、ヒトESL培地を調製する際には、一部のサプリメントは使用直前に追加されます。

これらには、BFGF、アスコルビン酸、Aに活性があり、転移するヒトインスリンが含まれます。次に、プレートコーティングの直前にマトラゲルまたはヒトラミニンの作業溶液を作ります。ゼラチンプレコート組織培養プレートを調製した後、5%二酸化炭素中で37°SIUでプレートをインキュベートします。

ゼラチンは、マトリゲルまたはラミニンの作業溶液に置き換えることができます。これらのプレートを摂氏4度で一晩インキュベートしてコーティングします。まず、ヒトES細胞コロニーを5〜7日間成長させ、その後分裂する準備をします。

それらのいくつかは、75%以上のコロニーを選択します未分化ヒトES細胞は、通常、わずかに不透明で、エッジがはっきりしています 蓄積された細胞を含むコロニー。分化の始まりの兆候は、通常、ほとんどが分化した細胞を含む白いコロニーであるように見えますが、通常は明確であるように見えます。ホワイトコロニーまたはクリアコロニーは選択しないでください。

プレートを光にかざし、マーカーを使用して、アウトラインに沿ってプレートの底にあるわずかに不透明なコロニーの輪郭を描きます。滅菌済みのP 2ピペットチップの端を使用して、周囲の線維芽細胞層をヒトES細胞コロニーから剥離します。次に、周囲の線維芽細胞細胞を切除し、コロニーの分化した部分もすべて除去します。

次に、分離した分化細胞を含む古い培地を吸引します。次に、各ウェルで未分化細胞をBFGFを欠くヒトE細胞培地で1回洗浄し、次にB-F-G-F-B-F-G-Fを含む3ミリリットルの新鮮なヒトESL培地を新鮮な培地に添加します。次に、滅菌済みのP 2ピペットチップを使用して、コロニーを細かく切断し、プレートから取り外します。

メディア内の分離されたコロニー片を50ミリリットルの円錐管に引き込みます。追加のものを引っ張ります。ミリリットルのメディアは、ウェルごとにすすぎます。

これで、細胞は低分子を使用してさらに分化する準備が整いました。コーティングしたばかりのプレートを摂氏37度に温めることから始めます。プレートからコーティング溶液を吸引し、コロニー片を含む培地の4ミリリットルのアリコートを各ウェルに加え、プレートを振らずに静かにインキュベーターに移します。

プレートを邪魔して種まきを許さないでください。3日間播種した後、オミック酸を配合した培地を新たに作製します。次に、古いメディアのほとんどを取り出し、セルが水没したままになるのに十分なメディアを残します。

細胞がそれぞれに乾燥することは決して許されるべきではありません。よくBFGFとレッチノ酸を含む4ミリリットルの新鮮なヒトES細胞培地を追加します。1日おきに培地を交換し、レッチノ酸処理したヒトES細胞コロニーを増殖させます。

7〜8日後、細胞は形態学的に大きく分化した細胞に変化します。次に、浮遊細胞培養を進めて、自発的に分化して移動して線維芽細胞層を形成した細胞からESLコロニーを分離することから浮遊培養を開始します。滅菌ピペットチップで前述の技術を使用し、浮遊分離した線維芽細胞を含む古い培地を吸引します。

細胞をHESC培地で一度洗浄し、3ミリリットルのHESC培地に再懸濁します。現在、滅菌済みのP 2ピペットチップを使用しています。コロニーを細かく切り、プレートから取り除きます。

分離したコロニーを持つメディアを単一の50ミリリットルの円錐管に引っ張ります。ウェルを1ミリリットルのメディアですすぎ、すすぎをプールに加えます。次に、プールされた細胞の4ミリリットルを6ウェルの超低アタッチメントプレートの各ウェルに4〜5日間分注し、プレートをインキュベーターに保管します。

この間、浮遊細胞クラスターまたは神経芽細胞が形成され、神経芽細胞をより成熟した神経細胞表現型にさらに進行させます。それらを含むメディアを50ミリリットルの円錐形チューブに引き込みます。次に、細胞を1, 400 RPMで5分間遠心分離します。

吸引し、できるだけ多くの古いメディアを秤量し、VEGF N NT threeとBDNFを含む新鮮なNSCメディアを同量追加します。ピペッティングで細胞を懸濁液に混合し、ウェルあたり4ミリリットルの懸濁液を6つに分注します。ウェル組織培養プレートは、プレートを摂氏37度の加湿インキュベーターに移します。

神経芽細胞は、マトリゲルでの3D培養のために一晩培養プレートに付着するか、神経芽細胞懸濁液にヒトラミネートします。そして、3Dマトリックスは摂氏37度で重合します。メディアは一日おきに交換してください。

2週間以内に、神経突起を持つニューロン細胞と色素細胞の広範なネットワークは、レッチノ酸が、定義された培養系で維持されているヒトES細胞を誘導するのに十分であるように見えます 多能性から神経表皮表現型への移行。未分化のヒトE細胞をレチノイン酸に曝露すると、コロニー内のすべての細胞は、多能性に関連するマーカーOCT4を発現しなくなった大きな分化細胞への形態学的変化を受けました。また、細胞は、HNK one a、P two、TRKCなどのさまざまな神経外胚葉関連マーカーを発現し始めました。

これらの大きな分化細胞は増殖を続け、コロニーのサイズは自然発生的に増加し、初期のニューロンマーカーであるベータ3チューブリンを発現しました。より成熟したニューロンマーカーマップ2は、細胞が積み重なったコロニーの領域に現れ始めました。偶然にも、神経外胚葉細胞の出現とともに、ニューロン特異的転写因子NERは、核内に配置されたチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子のドーパミン作動性ニューロンの分化と活性化に関与していました。

剥離後、レッチン酸処理したヒトES細胞は、塩基性FGFの除去時に懸濁培養で神経芽細胞を形成し、神経芽細胞を組織培養プレートに付着させた後、CNSに典型的な神経突起を持つ神経細胞と色素細胞の広範なネットワークが現れ始め、効率が劇的に向上し、3ヶ月以上培養することができました。これらのヒトES細胞由来の神経細胞は、レッチノ酸処理を伴わない細胞の自発的な多系統分化と比較してβ3チューブリンを発現し、共発現したマップ2を一度習得した。この技術は、適切に実施されれば、多能性ヒト胚性幹細胞からニューロン細胞にニューロン前駆細胞を約4週間で均一に生成するために使用できます。

ヒト細胞を扱う作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する前に、細胞株に病原体やマイコプラズマがないことを確認するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。