Name: 小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 学ぼう、多能性ヒト胚性幹細胞からレチノ酸を用いた小分子誘導法で神経前駆細胞と神経細胞を効率的に導出する手法。この方法は神経再生医療への応用が期待される。

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XHPは、国立老化研究所（NIHK01AG024496）と母子保健と人間開発のユニスケネディシュライバー国立研究所（NIHR21HD056530）から健康（NIH）助成金の国立研究所によってサポートされています。

1。ソリューションとメディアの準備<ol><li>ゼラチンコーティング溶液：4で0.1％（w / v）ののddH 2 O、オートクレーブでゼラチンと店舗℃の</li><li>マトリゲルコーティングソリューション。ストック溶液：° C一晩、10mlの氷冷DMEMまたはDMEM/F12を追加、よく混ぜて、アリコートを1ml /滅菌組織培養フードの下にチューブ、-20℃で保存します。4でゆっくりと解凍マトリゲル（10ml）をワーキングソリューション：遅い雪解け4で1ミリリットルマトリゲルのアリコート° C DMEMまたはDMEM/F12を冷やして14ミリリットルまで1-2時間、転送およびコーティングの直前に滅菌組織培養フードの下によく混ぜる。 </li><li>人間のラミニンコーティング溶液：希釈1ミリリットルのヒトラミニン溶液を氷冷DMEMまたはDMEM/F12へと（トリスでは0.5 mg / mlの-80店舗、NaClをバッファ° C、1〜2時間、4℃でゆっくりと解凍） 12.5ミリリットルワーキング溶液（40μg/ ml）を滅菌​​組織培養フードの下にすぐにコーティングの前に。 </li><li>成長因子のストック溶液（500 - 1000X）：10μgのに成長因子を溶かす滅菌緩衝液に/ mlの（0.5％BSA、1.0mMのDTT、10％グリセロール、1XPBS）と-80℃で50〜100μL/チューブアリコートなどの店舗℃まで</li><li>オールトランスレチノイン酸ワーキングソリューション（1000X）：DMSO中の10mM、-80℃でアリコートの店舗℃に</li><li> hESCのメディア：DMEM/F12またはKO - DMEM（80％）、KO血清の交換（20％）、L -アラニル- L - GLNまたはL - GLN（2 mM）を、MEM非必須アミノ酸（MNAA、1X）、およびβ-メルカプトエタノール（100μM）、フィルタリングして4℃で保存、使用前に20 ng / mlのbFGFを補充したC、。または定義されたコンポーネントで、"（KO）血清代替物をノックアウト"交換：DMEM/F12またはKO - DMEM（100％）、L -アラニル- L - GLNまたはL - GLN（2 mM）を、MNAA（1X）、MEM不可欠アミノ酸（MEAA、1X）、およびβ-メル​​カプトエタノール（100μM）は、濾過し、4℃のbFGF（20 ng / ml）を、ヒトインスリン（20μg/ ml）を、アスコルビン酸（濃度50μg/を添加したC、使用前にml）を、人間のアクチビンA（50 ng / ml）を、（10 mg / ml）をAlbumax /ヒトアルブミン、およびヒトトランスフェリン（8μg/ mlの）。 </li><li> NSCメディア：DMEM/F12（100％）、N - 2 supplemeNT（1X）、ヘパリン（8μg/ mlの）。 </li></ol> 2。プレートコーティング<ol><li>ゼラチンでコートプレートは6ウェルプレートにゼラチン溶液を2.5ml /ウェルを追加し、37℃の加湿インキュベーターで一晩インキュベートする。 </li><li>コー​​トのラミニンとプレート：チルゼラチンコートプレートとゼラチン削除は、2.5 mlを追加/予備冷却にもマトリゲルまたはヒトラミニンコーティングワーキングソリューションは、4℃で一晩6ウェルプレートとインキュベートしてゲル化。 </li></ol> 3。定義された条件の下で未分化ヒトES細胞を継代し、シーディング<ol><li>ヒトES細胞のコロニー5-7日齢に成長できるように、と解剖顕微鏡（プリウォーム37に段階を解剖° C）滅菌フードを解剖下にヒトES細胞培養プレートを取る。 </li><li>ヒトES細胞のコロニーを分割する]を選択します。形態学的に、これらのコロニーは、定義されたエッジ国連に通常わずかに不透明&gt; 75％未分化ヒトES細胞を（小さなコンパクト細胞）、（白積み重ねではない細胞ではなく、明確な分化細胞）が必要です解剖顕微鏡をderneath。慎重に選択したコロニーを概説し、コロニーと、すべての差別化された部品をP2滅菌ピペットチップのエッジを持つコロニーの（もしあれば）またはガラスキャピラリーを引っ張っ周囲の差別化された線維芽細胞の層を取り除く。 （解剖顕微鏡による100％未分化な、&gt; 75％が未分化は通常、通過点として考えられている優先するものの、これを知る論文の細胞に難しい、さらに最適な条件下で自発的な分化を受け、人工多能性ヒトESが一時的な段階にある、注意してください。分化した細胞は通常、シードされず、継代過程で除去、成長を続ける） </li><li>吸引することで、浮動戸分化細胞を含む古いメディアを削除します。かつてhESCのメディア（bFGFを除く）で洗浄する。 3ミリリットル/ウェル20 ng / mlのbFGFを含む新鮮なhESCのメディアを追加します。 </li><li>小片に未分化ヒトES細胞のコロニーを切断し、滅菌ピペットチップを使用してデタッチまたはガラスキャピラリーを引っ張った。</li><li> 50 mlコニカルチューブに一緒に分離されたコロニーの部分を含むメディアプール。を1ml /一緒に20 ng / mlのbFGFおよびプールを含むだけでなくhESCのメディアで一回プレートを洗浄してください。 </li><li>コー​​ティングされた新鮮なプレートからマトリゲルまたはヒトラミニン液を吸引除去する。 6ウェルプレートにコロニーの部分を含むアリコート4ミリリットル/よくhESCのメディア。静かに振盪せずに培養器にプレートを転送し、5％CO 2の雰囲気で加湿37℃のインキュベーターを乱すことなく一晩コロニーピースシードを許可する。 </li></ol> 4。レチノイン酸で定義された培養システムの下でヒトESの神経誘導<ol><li>播種後3日目に、プレートの各ウェルから古いメディアのほとんどを削除し、ヒトES細胞のコロニーは、（ヒトES細胞が乾燥しても決して許さない）浸水することを許可するのに十分なメディアを残す。 20 ng / mlのbFGFおよび10μMのレチノイン酸を含む4ミリリットル/よく新鮮なhESCのメディアと交換してください。 </li><li> 20 ng / mlのbFGFを含む新鮮なhESCのメディアと古いメディアを交換し、10μMのレチノイン酸一日おきに、と神経誘発性hESCのコロニーは、7日または8に成長することができます。コロニー内のすべてのセルは、乗算を続ける大規模な分化細胞に形態変化を受けることになる。コロニーは、7日または8でプレートをカバーする大きさで増加し、細胞がコロニーのいくつかの分野で積み上げを開始します。 </li></ol> 5。浮遊培養での継続的な神経分化<ol><li>滅菌フードを解剖下に解剖顕微鏡（37〜プリ暖かい解剖段階° C）へのヒトES細胞培養プレートを取る。慎重にコロニーを概説し、P2滅菌ピペットチップのエッジでコロニーを取り巻く線維芽細胞の層（分化した細胞がコロニー外に移行）を削除したり、ガラスが管を引っ張った。 </li><li>吸引することで、浮動戸線維芽細胞を含む古いメディアを削除します。かつてhESCのメディア（bFGFを除く）で洗浄する。 3ミリリットル/ウェルの新鮮なhESCのメディア（bFGFをせずに）を追加します。 </li><li>カット神経- I細かくnduced hESCのコロニー、および滅菌ピペットチップを使用してデタッチまたはガラスキャピラリーを引っ張った。 </li><li> 50 mlコニカルチューブに一緒に分離されたコロニーの部分を含むメディアプール。一緒に1ミリリットル/ウェルhESCのメディア（bFGFを除く）と、プールで一回プレートを洗浄してください。 </li><li>分注し4ミリリットル/よく4〜5日間を形成する浮遊細胞のクラスターを（神経芽細胞）を許可するには、37℃加湿インキュベーター中、6ウェル超低取付板とインキュベートしてコロニーの部分を含む無血清hESCのメディア。 </li></ol> 6。接着培養におけるニューロン表現型の成熟<ol><li> 50 mlコニカルチューブに一緒にフローティング神経芽細胞を含むメディアプール。 5分、1400 rpmで遠心する。あなたができる限り古い培地を吸引除去し、VEGF（20 ng / ml）を、NT - 3（10 ng / mlの）、およびBDNF（10 ng / ml）を含有する新鮮なNSCメディアの同量を追加します。 </li><li> 4ミリリットル/ウェル、6ウェルプレートにフローティング神経芽細胞と一定量を混合するために上下にピペッティングし。神経芽細胞はまた、SEになることができるラミニン/コラーゲン（マトリゲル）またはヒトラミニン重合VEGF（20 ng / ml）を、NT - 3（10 ng / mlの）、およびBDNF（10 ng / ml）を含む無血清NSCメディアにおける3次元マトリックスでeded 。神経芽細胞は一晩アタッチできるように37℃の加湿インキュベーターにプレートを転送する。 </li><li> VEGF（20 ng / ml）を、NT - 3（10 ng / mlの）、およびBDNF（10 ng / ml）を一日おきにを含むNSCのメディアを交換してください。神経突起有利子神経細胞と色素細胞の広範なネットワークは、連続培養し、時間と数の増加の2週間以内に表示されるようになります、そして3ヶ月以上持続することができます。 </li></ol> 7。代表的な結果： レチノイン酸（RA）が独占的に多能性の神経外胚葉性の表現型（ 図2A）に移行するために定義された培養系で維持ヒトES細胞を誘導するのに十分レンダリングされます。 RAへの未分化ヒトES細胞の露光時に、コロニー内のすべてのセルは形態変化を受けることになる多能性関連マーカーを発現停止大きな分化した細胞は、などのOCT - 4で示され、様々な神経外胚葉関連などHNK1ようなマーカー、、AP2、およびTrkCを（ 図2B）を発現始まります。これらの大規模な分化細胞は、乗算していきますし、コロニーが初期神経マーカーβ- III -チューブリン（ 図2B）を発現するために自発的に進んで、サイズが大きくなります。より成熟した神経のマーカーMAP - 2は細胞が（ 図2B）積み上げてきたコロニーの地域で表示されるようになります。神経外胚葉細胞と神経分化の外観と一致する、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）遺伝子16のドーパミン作動性ニューロンの分化活性化に関与する神経細胞特異的転写因子Nurr1は、核（ 図2B）に転位するでしょう。取り外した後は、RA処理したヒトES細胞は、懸濁液のカルトに浮遊細胞のクラスターを（神経芽細胞）が形成される神経分化のプロセスを継続するものをいい、ラベルにより表示。 bFGFおよび組織培養プレートに付着または無血清定義された培地中でラミニン/コラーゲン重合3次元マトリックス中に播種する神経芽細胞を許可した後、β- III -チューブリンとMAP - 2発現、神経突起の除去時に有利子細胞と色素細胞は、同じ期間での治療なしでヒトES細胞の自発的な多系統分化に比べて効率の大幅な増加と表示されるようになります、そして3ヶ月以上（ 図2C）のために持続することができる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1に排他的に小分子の単純な提供により、特定の臨床的に意義のある系統のヒト多能性幹細胞のよく制御された効率的な誘導の概略図。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2 。（A）回路図は、ヒトES細胞の指示神経分化のプロトコルのタイムラインを描く。コントロールとして、模擬処理（DMSO）ヒトES細胞に比べて（B）定義された培養システムの下でレチノイン酸（RA）への未分化ヒトES細胞の曝露時には、コロニー内の大規模差別OCT - 4（赤）陰性細胞は、現れ始めた。 RA誘導性差別OCT - 4陰性細胞が発現するHNK - 1（赤）、AP2（赤）、TrkC（緑）、および初期の神経外胚葉の分化と一貫してβ- III -チューブリン（赤）、し始めた。これらの細胞は、最終的に通常の細胞を蓄積し始めたの分野における神経マーカーMAP - 2（緑）を発現する成熟し続けた。神経外胚葉細胞と神経分化の外観と一致する、で神経細胞特異的転写因子Nurr1（緑）、関与ドーパミン作動性ニューロンの分化チロシンヒドロキシラーゼ（TH）遺伝子の活性化は、核へ移行。すべての細胞はその核のDAPI染色（青色）で表示されます。 β- III -チューブリン（赤）およびMAP - 2を（緑、3次元マトリックスに示されている）を発現する神経突起有利子細胞の広範なネットワークにより評価される（C）RAの治療は、高効率で神経細胞系に向かって分化を誘導する。矢印は、中枢神経系におけるそれらの典型的な色素細胞を示している。すべての細胞は、インセットで、その核のDAPI染色（青色）で表示されます。スケールバーは0.1ミリメートル。

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著者らは、競合する利害を宣言する。 XHPはXceltheraの創設者です。 XHPとEYSは、ヒトES細胞に関連する知的財産を持っている。

発達研究と臨床の翻訳の両方の主要な課題の一つは、効率的かつ予測可能所望の表現型に多能性ヒト幹細胞の広範な分化能をチャネルする方法をされています。そのような細胞が多系統の集約の段階を経由して、すべての胚葉の細胞に試験管内で自発的に区別することができますが、細胞のほんの一部は、特定の系統の1,4を追求する。これらのヒトES細胞由来の凝集体では、三胚葉の層に存在する可能性が広く発散望ましくない細胞型のかなりの量の同時出現はしばしば非効率的なだけでなく、目的の表現型の出現になりますが、手に負えないと信頼できないとしても。心臓と神経系は、しかし、前回のレポートでtransplantatio以下の多能性細胞の胚​​葉誘導および腫瘍形成のリスクが高いを通じて特殊な細胞を生成する際に非効率性を導出しているが、nは、さらなる臨床の翻訳を妨げている。 hESCの行は最初に成長-逮捕されたマウス胚性繊維芽細胞（MEF）4との共培養で導出され、維持された。いくつかのヒトフィーダーは、フィーダーフリー、および化学的に定式化培養系がヒトES 11月13日のために開発されているが、ヒト多能性細胞の自己複製を維持するために必要かつ十分な要素が未解決のままです。これらの外因性フィーダー細胞と生物学的試薬は、発達の信号に応答する多能性幹細胞の能力をマスク一方、未分化ヒトES細胞の長期的な安定成長を維持するのに役立ちます。忠実な展開と制御可能な直接差別化を可能に定義されている生物学的製剤血清培養系で未分化ヒトES細胞を維持することは、それらの治療的有用性と可能性への鍵の一つです。 RAは、以前に報告されたコンディットの下で保持未分化ヒトES細胞の神経分化を誘導するのに十分ではなかった外因性フィーダー細胞を含むイオン。神経系はRAでヒトES細胞に分化した多系統の集約を（胚様体）の治療、hESCの分化の比較的早い段階で表示されますがわずかにニューロン1、14、15の低収量を増加させた。一様に特定の系統のヒト多能性幹細胞の変換を達成するために、我々は特定の臨床的に意義のある系統に独占的に多能性ヒトES細胞の十分に制御された効率的な誘導のための条件を識別するために、未分化ヒトES細胞の増殖を保証することのできる定義された培養系を採用小分子の単純な提供（ 図1、図2）によって。今後の研究は再生治療のために臨床的に意義のある系統を派生させる場合にhESCの多能性の運命の小分子を介した直接制御と変調のための道を開く可能性がある、代替案として、ヒトCNSの開発に遺伝的およびエピジェネティックな制御分子を明らかにする。 RA治療、1-5なし％のヒトESはニューロン1、14、15に自発的な分化を受けることになる。 RAの治療では、我々は、人間の胚発生14をエミュレートする可能性があるプロセスで定義する文化の下で保持ヒトES細胞から&gt; 95％の胚性神経前駆細胞と神経細胞を生成することができた。最近、遺伝子を決定する既知の神経の運命は0.5から8パーセント17、18までの低効率と大人の神経前駆細胞と神経細胞にマウスの線維芽細胞の分化形質転換するために使用されている。しかし、再プログラム体細胞は、歴史的に異常な遺伝子発現および障害の治療ユーティリティ19から21までの加速老化と関連している。最後に、我々はここで確立されたプロトコルは、内部細胞塊（ICM）またはヒトの胚盤胞4の胚盤葉上層に由来する多能性ヒトES細胞に限定され、動物由来ES細胞を含む他の多能性細胞、には適用されない場合があります、以前の桑実胚（8から得られるES細胞-セル）段階の胚22、およびartificially再プログラム細胞23。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>シグマ</td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>バイオサイエンスBD </td><td> 356231 </td><td>成長因子は減少</td></tr><tr><td>人間のラミニン</td><td>シグマ</td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td>オールトランスレチノイン酸</td><td>シグマ</td><td> R2625 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td>インビトロジェン</td><td> 10565018 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM - KO </td><td>インビトロジェン</td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替物</td><td>インビトロジェン</td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸溶液（MNAA、100X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM美濃酸溶液（MEAA、100X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>インビトロジェン</td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td>インビトロジェン</td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td>ヒトトランスフェリン</td><td>シグマ</td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td>ヒトbFGF </td><td>ぺプロ</td><td> AF - 100 - 18B </td><td></td></tr><tr><td>人間のインスリン</td><td>インビトロジェン</td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td>人間のアクチビン</td><td>ぺプロ</td><td> 120 - 14E </td><td></td></tr><tr><td>人間のBDNF </td><td>ぺプロ</td><td> AF - 450から02 </td><td></td></tr><tr><td>ヒトVEGF </td><td>ぺプロ</td><td> AF - 100から20 </td><td></td></tr><tr><td>人間NT - 3 </td><td>ぺプロ</td><td> 450から03 </td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</tD&gt; <td>シグマ</td><td> H5284 </td><td></td></tr><tr><td> N - 2サプリメント（100X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 17502048 </td><td></td></tr><tr><td> 6ウェル超低取付板</td><td>コー​​ニング</td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6ウェルプレート</td><td>コー​​ニング</td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

今日の医療業界で損傷した中枢神経系（CNS）の構造と回路の修復や再生のための臨床的に適切な人間の神経細胞のソースのための大規模な満たされていない必要があります。細胞ベースの治療は、中枢神経系疾患のための失われた神経組織と機能を復元するために偉大な約束を保持する。しかし、に基づいて、細胞治療CNS由来の神経幹細胞は、広範囲1-3継代後の培養と失敗可塑性におけるそれらの限られた拡張機能のため、臨床現場で使用するための供給制限や困難に遭遇した。いくつかの有益な成果にもかかわらず、CNS由来のヒト神経幹細胞は、（hNSCs）内因性細胞が1-3を救うために栄養と神経保護分子を製造を通じて、主に彼らの非神経子孫で、その治療効果を発揮するように見える。また、多能性ヒト胚性幹細胞（ヒトES）supplyinによる神経疾患の幅広い申し出る治療グラム再生1,4-7のための開発CNSにおけるヒト神経細胞タイプの多様性。しかし、所望の表現型に効率的かつ予測可能な多能性ヒトES細胞の広い分化能をチャネルする方法を発達研究と臨床の翻訳の両方にとって大きな課題となっています。従来のアプローチは、しばしば表現型の異質性と不安定性、それゆえ、腫瘍形成7-10のリスクが高いが続いている非効率的で制御不能系統コミットメントの結果として、自発的な胚層の差別化による多能性幹細胞の多系統傾きに依存しています。加えて、未定義の動物/外国の生物学的なサプリメントおよび/ ​​または一般的に単離のために使用されているフィーダ、拡張、およびヒトES細胞の分化は11月13日 、問題のある患者ではそのような細胞の特殊な移植を直接使用することがあります。これらの障害を克服するために、我々はのために必要かつ十分な定義培養系の要素を解決して臨床的に適切なヒトES細胞の de novo導出するためのプラットフォームとして、ヒトES細胞の胚盤葉上層のpluripotenceをustainingと効果的に小分子14（ 図で回路図を参照してください。1）により臨床的に意義のある系統に向かって一様にそのようなヒトES細胞を演出。レチノイン酸（RA）がフィーダ1、14で維持未分化ヒトES細胞の神経分化を誘導しない。とマウスのES細胞とは異なり、ヒトES細胞に分化した胚様体（EB）を治療することで、わずかにニューロン1、14、15の低収量を増加させる。しかし、小分子および増殖因子の様々なスクリーニングした後、我々はそのような定義された条件は、さらに、人間の神経前駆細胞と神経細胞を生成した神経芽細胞に進行多能性ヒトES細胞から直接神経外胚葉の仕様を誘導するレチノイン酸（RA）が十分なレンダリングされたことがわかった高効率で開発するCNS（ 図2）。我々は、神経の誘導のための条件を定義細胞ベースの治療のための発達段階のスペクトルにわたって人間の神経細胞の大量供給のよく制御された効率的な導出を可能に介在する複数の系統胚様体のステージのない多能性ヒトES細胞から直接爆発、。

私たちは、人間の神経前駆細胞の大量供給と神経修復のための開発CNSにおける神経細胞の種類の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接、神経芽細胞の誘導のためのプロトコルを確立している。

損傷した中枢神経系の修復または再生に向けた、臨床的に適したヒト神経細胞源に対する大きな未充足のニーズが存在します。

本実験の全体的な目的は、低分子化合物による誘導を用いて、多能性ヒト胚性幹細胞から直接的かつ排他的に神経細胞系譜を分化させることです。これは、規定の条件下で維持された未分化細胞にレチノイン酸を添加することで達成されます。次に、細胞を剥離させて浮遊培養へと移行し、そこで神経芽細胞と呼ばれる浮遊細胞クラスターを形成させることで、分化プロセスを継続させます。神経芽細胞を神経分化培地を用いて組織培養プレートに接着させると、成熟神経細胞の特性を持つようになります。最終的に、免疫蛍光染色とデコンボリューション顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いることで、レチノイン酸処理がヒト胚性幹細胞の形態およびマーカー発現に及ぼす影響を示すことができます。他の手法では、ごく一部の細胞しか神経細胞の表現型を示しませんが、本手法では、低分子化合物を単純に添加することで、多能性ヒト胚性幹細胞を神経系 lineage へと効率的かつ高度に制御して誘導することが可能です。ストック溶液を調製する際、注意すべき点がいくつかあります。Matrigelとヒトラミニンは、-80°Cから4°Cまで一晩かけてゆっくりと融解させてください。培地は4°Cで保存し、使用前には必ず37°Cに温めてください。また、ヒトESL培地を調製する場合、一部のサプリメントは使用直前に添加します。これらには、BFGF、アスコルビン酸、活性ヒトインスリンA、およびトランスフェリンが含まれます。次に、プレートのコーティング直前に、Matrigelまたはヒトラミニンのワーキングソリューションを調製します。ゼラチンでプレコートした組織培養プレートの準備が完了後、プレートを37 °C、5% CO₂条件下でインキュベートします。ゼラチンは、Matrigelまたはラミニン作動溶液で代用可能です。これらのプレートを4°Cで一晩インキュベートしてコーティングします。まず、ヒトES細胞コロニーを5〜7日間培養し、その後、継代の準備を行います。未分化のヒトES細胞のコロニーは、通常、細胞が積み重なり、境界が明確でわずかに不透明な外観を呈します。分化が進んだ細胞を主とするコロニーは、通常、透明に görünえます。また、分化が始まりつつあるコロニーは、通常、白色に見えます。白色または透明のコロニーは選択しないでください。75%以上の未分化細胞を含むコロニーを選択してください。プレートを光にかざし、マーカーを用いて、プレート底面のわずかに不透明なコロニーの周囲を縁取りします。滅菌済みのP2ピペットチップの端を使用して、ヒトES細胞コロニーから周囲の線維芽細胞層を剥離させます。その後、周囲の線維芽細胞を除去し、あわせてコロニーの分化した部分もすべて除去します。次に、分離した分化細胞を含む古い培地を吸引して取り除きます。続いて、各ウェルの未分化細胞をBFGFを含まないヒトE es細胞培地で1回洗浄し、使用直前にbFGFを添加した新鮮なヒトESL培地を3 mL加えます。次に、滅菌済みのP2ピペットチップを用いてコロニーを細かく切り、プレートから剥離させます。分離したコロニー片を培地とともに50 milliliterのコニカルチューブに回収します。さらに、ウェルあたり1 milliliterの培地で洗浄します。細胞は、低分子化合物を用いたさらなる分化誘導が可能な状態になりました。まず、コーティングした直後のプレートを37°Cに温めます。プレートからコーティング溶液を吸引し、コロニー片を含む培地を4 mLずつ各ウェルに分注した後、プレートを揺らさないように注意してインキュベーターに移します。プレートを動かさず、細胞を定着させます。3日間の定着後、オミック酸を含む新しい培地を調製します。次に、細胞が浸った状態を維持する程度の量だけ残し、古い培地の大部分を除去します。各ウェルの細胞が乾燥しないように注意してください。bFGFとレチノイン酸を含む新鮮なヒトES細胞培地を4 mL添加します。培地を隔日で交換し、レチノイン酸で処理したヒトES細胞コロニーを増殖させます。7〜8日後、細胞は形態変化を起こし、大きな分化細胞になります。次に、浮遊細胞培養の作製に進みます。浮遊培養を開始するには、自発的に分化し、遊走して線維芽細胞層を形成した細胞からESLコロニーを剥離させます。前述の手法を用いて滅菌済みのピペットチップで操作し、浮遊した剥離線維芽細胞を含む古い培地を吸引除去してください。細胞をHESC mediaで1回洗浄し、3 mLのHESC mediaに再懸濁します。次に、滅菌済みのP2ピペットチップを使用して、コロニーを小さく切り分け、プレートから剥離させます。分離したコロニーを含む培地を、1本の50 milliliterコニカルチューブに回収します。ウェルを1 milliliterの培地で洗浄し、その洗浄液を回収分に加えます。次に、プールした細胞を4 milliliterずつ、6ウェル超低接着プレートの各ウェルに分注し、インキュベーター内で4〜5日間培養します。この間に、浮遊した細胞クラスターまたは神経芽細胞が形成され、神経芽細胞がさらに成熟したニューロン表現型へと進展します。これらを含む培地を 50 mL コニカルチューブに回収します。その後、細胞を 1,400 RPM で 5 分間遠心分離します。古い培地を可能な限り吸引して重量を測定し、同量のVEGF N NT threeおよびBDNFを含む新鮮なNSC培地を加えます。ピペッティングによって細胞を懸濁させ、6ウェル組織培養プレートの各ウェルに懸濁液を4 mLずつ分注します。その後、プレートを37 °Cの加湿インキュベーターに移します。ニューロブラストをMatrigelまたはヒトラミネートを含むニューロブラスト懸濁液とともに培養プレートに播種し、一晩置いて3D培養を行います。3Dマトリックスは37°Cで重合します。培地は1日おきに交換してください。2週間以内に、神経突起を持つ神経細胞と色素細胞の広範なネットワークが出現します。これは、定義された培養システムで維持されたヒトES細胞が、多能性から神経外胚葉表現型へと排他的に移行させるのに十分なレチノイン酸が作用したことを示しています。未分化なヒトES細胞をレチノイン酸に曝露すると、コロニー内のすべての細胞が形態的に変化し、多能性関連マーカーであるOCT fourの発現を停止した大きな分化細胞となりました。また、これらの細胞はHNK one a、P two、TRKCなどの様々な神経外胚葉関連マーカーの発現を開始しました。これらの大きな分化した細胞は増殖を続け、コロニーは次第に大きくなり、早期ニューロンマーカーであるbeta three tubulinを自発的に発現しました。より成熟したニューロンマーカーであるmap twoは、細胞が蓄積したコロニーの領域に現れ始めました。同時に、神経外胚葉細胞の出現に伴い、ドーパミン作動性ニューロンの分化およびチロシン水酸化酵素遺伝子の活性化に関与するニューロン特異的転写因子NER oneが核内へ移行しました。剥離後、レチノイン酸処理を施したヒトES細胞は、bFGFを除去することで懸濁培養中で神経芽細胞を形成しました。神経芽細胞を組織培養プレートに接着させたところ、CNSに特有の、神経突起を持つ神経細胞および色素細胞の広範なネットワークが劇的に効率よく出現し、3か月以上にわたって培養することができました。これらのヒトES細胞由来の神経細胞は、レチノイン酸処理のない細胞の自然な多系統分化と比較して、beta three tubulinを発現し、さらにmap twoを共発現していました。この手法を習得すれば、適切に実施することで、多能性ヒト胚性幹細胞から神経前駆細胞および神経細胞を約4週間で均一に作製することが可能です。ヒト細胞の取り扱いは極めて危険である可能性があるため、本手順を実施する前に、細胞株に病原体やマイコプラズマが混入していないことを確認するなど、常に適切な予防措置を講じてください。

efficient-derivation-human-neuronal-progenitors-neurons-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

私たちは、人間の心臓前駆細胞の大量供給と心血管修復のための機能的な心筋細胞の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接cardioblastsの誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

多能性ヒト幹細胞の神経分化（hPSCs）のためのプロトコルは、多くの場合、時間がかかり、実質的な細胞培養のスキルを必要とします。ここでは、制御された方法で人間の神経細胞の、簡便、迅速、かつ効率的に生成できるように、multititreプレートフォーマットへの小分子ベースの分化手順を適応している。...

Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成

このビデオは、非トランスジェニックおよびトランスジェニックヒト多能性幹細胞(hPSC)から神経前駆細胞を生成する方法を示しています。hPSCは、ニューロン分化培地を使用して神経前駆細胞に分化されます。非トランスジェニック細胞では低分子を用いて分化が誘導されますが、トランスジェニックhPSCは、ニューロン分化特異的な転写因子のプロモーターを誘導する抗生物質を添加することで分化します。...

非トランスジェニックおよびトランスジェニックヒト多能性幹細胞の神経前駆細胞への分化

私たちは、発生生物学からの知識と公開された研究に基づいて、ヒト胚性幹細胞とヒト人工多能性幹細胞の両方からA9中脳ドーパミン作動性ニューロンを効率的に生成するための最適化されたプロトコルを開発しました。これは、パーキンソン病の疾患モデリングと細胞補充療法に役立ちます。...

ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

この方法は、直接末梢血細胞から濃縮造血前駆細胞からのヒト神経幹細胞を誘導するために開発された。...

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

私たちは、興奮性皮質ニューロン12に人間の人工多能性幹細胞（hiPSCs）の、迅速な再現性、および効率的な分化を説明以前に公開されたプロトコルを変更して実施します。具体的には、私たちの修飾は、神経細胞の密度の制御を可能にし、ネットワークレベルでの電気生理学的特性を測定するために微小電極アレイ上で使用します。...

マイクロ電極アレイ上のネットワーク・アクティビティを測定するための人工多能性幹細胞の急速な神経分化

神経上皮組織の前例のない複雑さのために、人間の脳の発達をモデル化することが妨げられてきました。ここでは、ヒトの脳発生の初期のイベントを明らかにし、in...

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

このプロトコルは、仙台ウイルス感染による神経幹細胞を誘導する末梢血単核細胞のリプログラミング、ドーパミン作動性ニューロンへのiNSCの分化、DA前駆体の一方的な病変への移植を提示するパーキンソン病マウスモデル、およびPD治療のためのiNSC由来DA前駆体の安全性および有効性の評価。...

末梢単核細胞からの誘導神経幹細胞の生成と移植研究におけるドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化

ここで提示するプロトコルは、ヒト胚性幹細胞の単細胞培養の生成とその後の神経前駆細胞への分化のためのプロトコルである。プロトコルは、シンプルで堅牢でスケーラブルで、薬物スクリーニングや再生医療用途に適しています。...

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)培養の自動化と、自動イメージングと解析に対応した神経分化を示す。...

ヒト人工多能性幹細胞由来皮質およびドーパミン作動性ニューロンの統合されたライブ細胞モニタリングによる自動生産

学ぼう、多能性ヒト胚性幹細胞からレチノ酸を用いた小分子誘導法で神経前駆細胞と神経細胞を効率的に導出する手法。この方法は神経再生医療への応用が期待される。

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

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