小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

本実験の目的は、低分子化合物による誘導を用いて、多能性ヒト胚性幹細胞から心筋系の後代細胞を直接かつ特異的に誘導することである。これは、規定の条件下で維持された未分化ヒトES細胞にニコチンアミドを添加することで達成される。次に、心筋分化細胞を剥離させて、懸濁培養における浮遊細胞塊である心筋芽細胞（cardio blasts）を形成させる。

形成された心筋芽細胞を心筋分化培地に播種し、拍動する心筋細胞への分化を継続させます。最終的に、デコンボリューション顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いた免疫蛍光染色、および電気生理学的記録によって結果を評価します。この手法の主な利点は、低分子化合物を添加するだけで、ヒト多能性胚性幹細胞を効率的に心筋系のみに誘導できることです。

既存の多系統分化法では、心筋表現型を示す細胞はごく一部に限られています。ストック溶液を調製する際、注意すべき点がいくつかあります。Matrigelおよびヒトラミニンは、-80 °Cから4 °Cまで一晩かけて緩徐に融解させてください。培地は4 °Cで保存し、使用前に必ず37 °Cに温めてください。

また、ヒトESC培地を調製する際、いくつかのサプリメントは使用直前に添加します。これにはBFGF、アスコルビン酸、ヒトインスリン、およびトランスフェリンが含まれます。次に、プレートへのコーティングの直前に、Matrigelまたはヒトラミニンのワーキングソリューションを作成してください。

ゼラチンをあらかじめコーティングした組織培養プレートを準備した後、5% 二酸化炭素条件下、37 °Cでプレートをインキュベートします。ゼラチンの代わりに、マトリゲルまたはラミニンのワーキングソリューションを使用することも可能です。これらのプレートは、4 °Cで一晩インキュベートしてコーティングします。

まず、ヒトES細胞のコロニーを5〜7日間培養し、その一部を継代する準備をします。未分化なヒトES細胞が75%以上含まれるコロニーを選択してください。これらのコロニーは通常、境界が明確で、細胞が積み重なっているため、わずかに不透明に見えます。分化が始まっている兆候は、通常、白色のコロニーとして現れ、ほとんどが分化した細胞で構成されるコロニーは、通常、透明に見えます。

白色または透明のコロニーは選択しないでください。プレートを光に透かし、プレート底面のわずかに不透明なコロニーの輪郭に沿って、マーカーで囲んでください。滅菌済みのP2ピペットチップの端を使用して、ヒトES細胞コロニーから周囲の線維芽細胞層を切り離します。

次に、周囲の線維芽細胞およびコロニーの分化した部位をすべて取り除きます。続いて、剥離した分化細胞を含む古い培地を吸引して除去します。次に、各ウェルの未分化細胞をbFGF不含のヒトES細胞培地で1回洗浄し、bFGFを添加した新鮮なヒトES細胞培地を3 mL加えます。なお、bFGFは使用直前に新鮮な培地へ添加してください。

次に、滅菌済みのP2ピペットチップを使用してコロニーを小さく切り刻み、プレートから切り離します。切り離したコロニーを培地ごと50 mLコニカルチューブに回収します。さらに、ウェルあたり1 mLの培地で洗浄し、それを回収します。

これで、低分子化合物を用いたさらなる分化誘導への準備が整いました。まず、コーティング直後のプレートを37°Cに温めます。プレートからコーティング溶液を吸引して除去し、コロニー片を含む培地4 mLを各ウェルに分注した後、プレートを揺らさないように注意してインキュベーターに移してください。

細胞が接着するように、プレートを動かさないでください。次に、細胞が浸したままである十分な量の培地だけを残し、古い培地の大部分を除去します。細胞を絶対に乾燥させないでください。

basic FGFとニコチンアミドを含む新鮮なヒトESL培地を調製し、各ウェルに規定量の培地を分注します。この培地は4 °Cで最大2週間保存可能であり、その期間中、コロニーを増殖させるために1日おきに細胞培養液の更新に使用できます。8〜10日後には、細胞は形態変化を起こし、分化した大きな細胞が分化・増殖して積み重なった状態になります。

次に、浮遊培養へと移行します。浮遊培養を開始するには、自発的に分化し、遊走して線維芽細胞層を形成した細胞からESLコロニーを切り離します。前述の手法を滅菌済みピペットチップを用いて行い、浮遊した遊走線維芽細胞を含む古い培地を吸引除去します。HESC培地で1回洗浄し、滅菌済みP2ピペットチップを用いて3 mLのHESC培地に再懸濁します。

コロニーを小さく切り分け、プレートから剥がします。剥がしたコロニーを含む培地を、1本の50 milliliterコニカルチューブに回収します。ウェルを1 milliliterの培地で洗浄し、その洗浄液を回収した培地に追加します。

次に、プールした細胞を、6ウェルの超低接着プレートの各ウェルに4 mLずつ分注し、4～5日間培養します。プレートをインキュベーター内に保持し、浮遊細胞クラスターまたは心筋芽細胞を形成させ、心筋芽細胞を拍動心筋細胞の表現型まで分化させます。その後、培地とともに50 mLコニカルチューブに回収します。

次に、細胞を1,400 RPMで5分間遠心分離します。上清を吸引し、古い培地をできる限り計量して除去し、同量の10 millimolar ニコチンアミドを含む新しい心筋分化培地を加えます。

ピペッティングで浮遊している心筋芽細胞を混ぜ合わせ、次に、6ウェル組織培養プレートの各ウェルに心筋芽細胞懸濁液を 4 mL ずつ分注します。プレートを 37 °C の加湿インキュベーターに移し、心筋芽細胞をオーバーナイトで組織培養プレートに接着させます。培養中は1日おきに操作を行います。

8日目に、10 mM のニコチンアミドを含む心筋分化培地を交換します。ニコチンアミドを含まない心筋分化培地に切り替え、その後も1日おきに培地交換を継続してください。

ニコチンアミドの除去後2週間以内に、拍動する心筋細胞が現れ始め、その数が増加します。ニコチンアミドは、規定の培養システムで維持されたヒトES細胞を、多能性から心・中胚葉表現型へと特異的に分化誘導するのに十分な効果を有しています。未分化ヒトES細胞をニコチンアミドに曝露すると、コロニー内のすべての細胞が形態的に変化して大きな分化細胞となり、OCT fourの発現が低下しました。また、これらの細胞は心臓特異的な転写因子NK X 2.5およびalpha actininの発現を開始しました。

どちらの特性も心臓中胚葉の表現型と一致しています。これらの分化した細胞は、細胞が蓄積したコロニー領域において増殖を続け、サイズが増大しました。NKX 2.5の発現はより強くなりました。剥離後、ニコチンアミド処理したヒトES細胞は、浮遊培養において心筋芽細胞を形成しました。

心筋芽細胞を接着させた後、ニコチンアミドで1週間処理した。ニコチンアミドを除去して1〜2週間後、拍動心筋細胞が出現し始め、その効率は劇的に向上した。これらは律動的な収縮を伴って脈動する細胞クラスターとして現れたが、IDE処理を行わなかった細胞の自発的な多系統分化では、これらの特性は発現しなかった。拍動心筋細胞クラスター内の細胞は、NKX2.5およびalpha actininを含む心筋細胞特有のマーカーを発現していた。

拍動する心筋細胞の収縮は、電気的プロファイルによって、強力でリズム感があり、協調的かつ十分に同調していることが確認されました。これらの細胞は、臨床的な心電図の体表電極で観察されるP-Q-R-S-T波形を彷彿とさせる規則的なインパルスを示しました。さらに、心筋細胞は、一度確立されれば3か月以上にわたって強力な収縮能を維持することができました。この手法を適切に実施すれば、多能性ヒト胚性幹細胞から、約5週間で心前駆細胞および拍動心筋細胞を一様に生成することが可能です。